Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2—1278
18 Глава 1
ем) 1 М NaCl, 20 мМ трис-НС1, pH 8,0, 10 мМ ЭДТА. Стерилизуют фильтрованием 40%-ная сахароза: готовят так же, как предыдущий раствор, но с 400 г сахарозы Агарозные чашки с бромистым этидием: несколько маленьких чашек Петри заливают 1%-ным раствором агарозы в ТЭ-бу-фере, содержащем бромистый этидий в концентрации 1 мкг/мл. Хранят при 4°С завернутыми в парафильм Буфер для лигирования (10Х): 0,5 М трис-НС1, pH 7,4, 0,1 М MgCl2, 0,1 М дитиотрейтол, 10 мМ ATP, 1 мг/мл БСА. Буфер для лигирования в 20-кратной концентрации (20Х), не содержащий АТР, хранят в замороженном виде при —20 °С; АТР добавляют непосредственно перед использованием (0,1 М раствор, хранящийся в замороженном состоянии при —70 °С).
Буфер для разбавления фагов: 10 мМ трис-НС1, pH 7,4, 10 мМ MgSC>4, 0,01% желатины. Стерилизуют фильтрованием L-бульон: готовят 20 порций по 50 мл (Maniatis et al., 1982) L-бульон с ампициллином (амп): готовят, как указано выше, но с 50 мкг/мл ампициллина Чашки со средой L-амп: см. Maniatis et al., 1982. Добавляют 50 мкг/мл ампициллина. Готовят 100 больших чашек Nunc (23X23 см; A/S Nunc, Дания), 100 больших (с диаметром 15 см) и 50 маленьких чашек Петри Чашки с HMF-1 амп: 3,6 мМ К2НРО4, 1,3 мМ КН2РО4, 2 мМ цитрат натрия, 1 мМ MgS04, 1% триптона, 1% NaCl,
0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% агара, 5% глицерола. pH доводят до 7,5, добавляют 50 мкг/мл ампициллина и готовят 50 больших чашек Nunc Чашки с HMF-2 амп: готовят, как указано выше, но с 25% глицерола. 20 больших чашек Nunc ТНЭ-буфер: 50 мМ трис-НС1, pH, 8, 50 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА Раствор А для щелочного лизиса: 50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-НС1, pH 8, 10 мМ ЭДТА. Стерилизуют фильтрованием Раствор В для щелочного лизиса: 0,2 М NaOH, 1% ДСН. Готовят заново перед каждым опытом РНКаза А: РНКазу А растворяют в концентрации 10 мг/мл в 10 мкМ ацетате натрия, pH 5,0. Прогревают при 100 °С в течение 5 мин и хранят в небольших аликвотах в замороженном виде при —20 °С /XSSC: 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, pH 7,0
III. КОНСТРУИРОВАНИЕ КОСМИДНЫХ БИБЛИОТЕК
В нашей лаборатории по представленной ниже прописи было успешно сконструировано несколько космидных библиотек ДНК различных линий мышей. Процедуры, упомянутые в этой пропи-
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
19
I
си, разработаны ранее (Collins, Hohn, 1978; Grosveld et al., 1981, 1982; Ish-Horowicz, Burke, 1981; Maniatis et al., 1982). Последовательность процедур показана на рис. 1-1.
А. Частичный гидролиз эукариотической ДНК
При анализе на 0,3%-ных агарозных гелях высокомолекулярную ДНК (Blin, Stafford, 1976) с размерами, значительно превышающими 50 kb, подвергают частичному гидролизу рест-риктазой Sau3A. Необходимое количество фермента определяют, инкубируя 30 мин пять аликвот ДНК (каждая по 20 мкг) — с 0,07, 0,21, 0,8, 2 и 8 ед. фермента в пробе. Реакционные смеси готовят во льду. Реакцию начинают, перенося пробы в термостат на 37 °С, а останавливают, добавляя ЭДТА до конечной концентрации 50 мМ, после чего материал ставят вновь в ледяную баню. По 1 мкг ДНК из каждого гидролизата анализируют электрофорезом на 0,3%-ных агарозных гелях (16 ч, 40 В) вместе с маркерными фрагментами ДНК фага Я. Следует найти условия, в которых большая часть ДНК гидролизуется до фрагментов с размерами от 30 до 50 kb, однако можно также использовать условия, в которых большая часть фрагментов ДНК является несколько большей или несколько меньшей этих размеров. Считают, что при этом гарантируется сохранение последовательностей, которые присутствуют в областях, гидролизующихся быстрее или медленнее по сравнению со средней ДНК Проводят гидролиз десяти аликвот ДНК в оптимальных условиях и шести аликвот в условиях, когда образуются в основном фрагменты размером более 50 kb или менее 30 kb. Это делают так, как описано выше, гидролизаты проверяют с помощью гель-электрофореза и все аликвоты объединяют, включая те, которые были получены в первых ориентировочных экспериментах. В результате получают 400 мкг гидролизованной ДНК, которую подвергают однократной экстракции равным объемом фенола и затем однократной экстракции равным объемом сева-га. Если объем ДНК превышает 2 мл, то ее осаждают этанолом (Maniatis et al., 1982) и вновь растворяют в ТЭ-буфере (2 мл) в течение ночи.
Б. Фракционирование в сахарозном градиенте
Два сахарозных градиента (10—40%) готовят в полиалло-мерных пробирках для ротора SW27 Beckman. Градиент создают в пробирках с помощью соответствующего оборудования, внося в смеситель 40 мл 10%-ной и 40 мл 40%-ной сахарозы. Формирование градиента должно происходить в течение ~30 мин. Когда уровень сахарозного раствора будет примерно
2*
Упаковка
in vitro
-Лигирование
-t—| amp |~) gpt | cos
“> Реппицирование-
(4 x) v
\\ г//
Hoal* \
V
BamHI
С1а]*лИ^\
BamHI
