Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 10

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 4 5 6 7 8 9 < 10 > 11 12 13 14 15 16 .. 239 >> Следующая

1 л 2XSSC с 0,1% ДСН и открывают коробку бумажных полотенец Kleenex.
Четыре фильтра с материалом, который должен быть изолирован, кладут на Whatman ЗММ, смоченный в 10%-ном ДСН, стараясь избегать образования при этом пузырьков воздуха. Фильтры оставляют на 4 мин, после чего переносят в чашки с раствором для щелочного лизиса, а через 5 мин — в чашки с нейтрализующим раствором. Еще через 5 мин фильтры погружают в раствор трис-NaCl. В течение 5 мин раствор перемешивают покачиванием, а затем вынимают фильтры и кладут на стеклянную пластинку (колониями вверх). Бумажным полотенцем Kleenex, смоченным в растворе 2XSSC с 0,1% ДСН, тщательно убирают остатки бактерий (Grosveld et al., 1981). Фильтры погружают в раствор 2XSSC с 0,1% ДСН, который перемешивают покачиванием 5 мин и затем быстро промывают раствором 2xSSC. Высушивают фильтры на бумаге Whatman 3 ММ и прокаливают в течение 4 ч или ночи в вакуумной печи, после чего они готовы для скрининга с помощью гибридизации.
IV. СКРИНИНГ КОСМИДНЫХ БИБЛИОТЕК
А. Преинкубация
Фильтры смачивают в растворе 3XSSC с 0,1% ДСН; после того как они полностью смочились, их погружают в этот раствор и переносят в квадратную пластмассовую коробку
28 Глава 1
(23,5x23,5 см, высота 8 см с крышкой). Избыток буфера сливают и инкубируют стопку, состоящую из 20 фильтров (с фильтром-бланком наверху) в 200 мл буфера для преинкубации (50% формамида, 1 М NaCl, ЮХраствор Денхардта, 50 мМ трис-НС1, pH 7,5, 0,1% Na4P207, 1% ДСН, 150 мкг/мл обработанной ультразвуком и денатурированной ДНК из спермы лосося). При гибридизации в формамиде фильтры меньше повреждаются и дают более низкий фон. Если для гибридизации необходимы более мягкие условия (например, для межвидовой гибридизации или при использовании олигонуклеотидных зондов), то концентрацию формамида снижают. Фильтры инкубируют при постоянном встряхивании на ротационной качалке с водяной баней (Brunswick) при 42 °С 6 ч или дольше. Буфер для преинкубации заменяют на буфер для гибридизации (200 мл) (они различаются лишь концентрацией ДСН, которая в последнем составляет 0,1%). Инкубируют при 42 °С с перемешиванием
2 ч или дольше. (Примечание: Если фильтры уже использовались в реакции для гибридизации, то этап преинкубации можно опустить.)
Б. Гибридизация
Для гибридизации используют зонды, полученные с помощью ник-трансляции (Maniatis et al., 1982) (удельная активность 104—109 имп/(мин-мкг), и ДНК-конкурент (см. ниже). ДНК денатурируют путем инкубации в кипящей водяной бане или в нагревательном блоке (95 °С) в течение 5 мин и последующего быстрого охлаждения в смеси воды и льда в течение 1—2 мин. 1 мл гибридизационного раствора содержит от 105 до 10® имп/мин. Одновременно можно пользоваться несколькими зондами, однако общая радиоактивность в растворе для гибридизации не должна превышать 106 имп/(мин-мл), чтобы не возникало проблем, связанных с высоким фоном.
Если зонд загрязнен повторяющимися последовательностями ДНК и векторной ДНК, то в гибридизационную смесь вносят нерадиоактивную ДНК-конкурент [50 мкг высокомолекулярной ДНК мыши и 1—2 мкг ДНК pBR322 (гидролизованной рестриктазой НаеIII) на 1 мл гибридизационного раствора]. Так, например, однокопийный фрагмент, который выделяют с помощью гель-электрофореза из космидного клона, содержащего геномную ДНК мыши, но не подвергают дальнейшему субклонированию, обычно загрязнен небольшим количеством фрагментов, содержащих повторяющиеся последовательности ДНК и векторные ДНК (Steinmetz et al., 1982b). Продолжительность гибридизации составляет от 24 до 48 ч при 42 °С при постоянном перемешивании. По истечении половинного срока инкуба-
Методы, применяемые в молекулярной иммунологии
29
ции всю стопку фильтров, за исключением верхнего фильтра, переворачивают.
Один и тот же набор фильтров можно использовать для гибридизации многократно при скрининге библиотеки различными зондами. Удалять меченые зонды от предшествующих циклов гибридизации нет необходимости. Фильтры просто проводят через еще одну реакцию гибридизации, промывают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Новые положительные колонии выявляют путем сопоставления новых пленок с теми, которые были получены в предшествующих гибридизациях.
В. Промывка
После гибридизации гибридизационный раствор сливают и хранят при —20 °С. Его используют для повторного скрининга положительных колоний. Фильтр промывают в коробке двухлитровыми порциями подогретого буфера. Условия промывки можно варьировать. В большинстве случаев мы проводим промывку при 65°С два раза в растворе 3XSSC, 0,1%-ного ДСН и два раза в растворе lxSSC, 0,1%-ного ДСН. Продолжительность каждой промывки составляет от 20 до 30 мин. Ее осуществляют при постоянном перемешивании на ротационной качалке, снабженной водяной баней. Радиоактивность фильтров после промывки определяют с помощью счетчика Гейгера. По завершении последней промывки она должна быть близка к фону.
Г. Радиоавтография, проявление, хранение
Фильтры вынимают из коробки и раскладывают на бумаге Whatman 3 ММ для идентификации. Их не высушивают, а просто отжимают избыток жидкости. Для радиоавтографии фильтры помещают по два в кассету (для пленки размером 35X Х43 см) на заранее нарезанные листы бумаги Whatman 3 ММ так, что фильтры незначительно перекрываются в средней части. Начинают с фильтров № 1 и 2 на первом листе бумаги и помещают фильтры № 2 и 1 (в указанном порядке) на второй лист и т. д. Это позволит легко идентифицировать положительные колонии, в том числе и в тех областях, где фильтры перекрываются друг с другом. На бумагу Whatman 3 ММ в нескольких местах наносят метку с помощью радиоактивных чернил или маркера для радиоавтографии Ultemit (NEN) и нумеруют их номерами от 1 до 10. Фильтры закрывают пленкой Saran и прикрепляют ее к бумаге рядом с фильтрами, чтобы они не двигались. Для
Предыдущая << 1 .. 4 5 6 7 8 9 < 10 > 11 12 13 14 15 16 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed