Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
ОБРАЗЕЦ:
Свежая цельная кровь или цельная кровь с антикоагулянтом (например, ЭДТА, цитрат натрия, гепарин). Из 1 мл крови можно получить 30-60 мкг ДНК.
1. Перед исследованием жидкую кровь необходимо перемешать. Кровь можно хранить при +4°С пять дней, более длительное хранение при — 70°С.
2. 700 мкл жидкой крови перенести в 1,5 мл микропробирку типа Эппендорф. Добавить 700 мкл IX SSC и перемешать. Центрифугировать 1 минуту при 10000 — 15000 об/мин.
3. Удалить 1,0 мл супернатанта.
4. Добавить 1,0 мл IX SSC, встряхнуть на вортексе, центрифугировать 1 мин. при 14000 об/мин., полностью удалить супернатант. Осадок оставить в пробирке.
5. К осадку добавить:
375 мкл 0,2 М ацетата натрия.
12,5 мкл 10% SDS.
10 мкл протеиназы К (10 мг/мл).
6. Встряхнуть на вортексе (1 секунду) и инкубировать при 5б°С 1 час.
7. Добавить 120 мкл смеси фенол/хлоро-форм/изоамилового спирта (25:24:1). Перемешать на вортексе в течение 30 секунд.
8. Центрифугировать 2 минуты при 10000 об/мин. Перенести верхнюю водную фазу, содержащую ДНК, в, новую стерильную микроцентрифужную пробирку (не касаясь интерфазного слоя денатурированных белков).
9. К водной фазе добавить 1,0 мл холодного 96% этанола. Перемешать, переворачивая пробирку. Поместить пробирку на — 20°С как минимум на ,15 минут. Центрифугировать 2 минуты. ^
10. Удалить супернатант декантацией. Остатки этанола осторожно (не захватывая частиц осадка) удалить автоматической пипеткой.
11. К осадку добавить 180 мкл ТЕ буфера. Встряхнуть на вортексе. Инкубировать при 56°С 10 мин. Добавить 20 мкл 2,0 М ацетата натрия, встряхивать в течение 5 секунд.
12. Добавить 500 мкл холодного 96% этилового спирта. Слегка потрясти до образования гомогенного раствора. Центрифугиро-
вать одну минуту при 15000 об/мин. Удалить супернатант декантацией.
13. Промыть осадок 1,0 мл охлажденного 70% этилового спирта. Центрифугировать 1 минуту, супернатант декантировать. Автоматической пипеткой удалить остатки супернатанта. Осадок сушить при комнатной температуре 30-60 минут.
14. Добавить 200 мкл ТЕ буфера, перемешать, инкубировать при 56°С 12-14 часов в тер-мостате-шейкере. Центрифугировать 1 секунду.
15. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
16. Раствор ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
6. Выделение ДНК из крови методом экстракции органическими реагентами
ПРИНЦИП MF.TOAA:
При выделении ДНК используются органические растворители. В основе метода лежит лизис клеток крови под действием додецилсульфа-та натрия (SDS) и протеиназы К. Лизат клеток обрабатывают смесью фенол/хлороформ/изо-амиловый спирт. ДНК получают преципитацией
с использованием хлорида натрия и холодного этанола, а затем растворяют в трис-ЭДТА (ТЕ) буфере.
ОБРАЗЕЦ:
Свежая цельная кровь или цельная кровь с антикоагулянтом (например, ЭДТА, цитрат натрия, гепарин), пятна крови на твердом носителе (фильтровальная бумага, марля и др.).
1. В стерильную микроцентрифужную пробирку внести 0,5 мл лизирующего раствора.
2. Добавить 20 мкл жидкой крови или фрагмент носителя с пятном крови диаметром 1-5 мм.
3. Добавить 15 мкл протеиназы К (10 мг/мл), осторожно перемешать.
4. Инкубировать при температуре 56°С в течение 1-3 часов (лучше 12-14 часов). Длительность инкубации определяется характером объекта: давностью пятна и его насыщенностью. Эффективность очистки ДНК повышается, если на время инкубации поместить пробирку на качающуюся платформу.
5. К полученному продукту лизиса и ферментной обработки добавить равный объем фенола, перемешать на вортексе.
6. Центрифугировать в течение 3 минут при 10000 об/мин., до разделения двух фаз.
7. Пипеткой со стерильным наконечником перенести верхнюю, водную фазу в чистую микроцентрифужную пробирку.
8. Добавить равный объем смеси фенол/хло-роформ/изоамиловый спирт (25:24:1). Перемешать на вортексе.
9. Центрифугировать в течение 3 минут при 10000 об/мин, до разделения двух фаз.
10. Пипеткой со стерильным наконечником перенести верхнюю, водную фазу в чистую микроцентрифужную пробирку.
11. К водной фазе добавить 5М раствор NaCl до конечной концентрации 0,2 М и 2 —
2,5 объема холодного 96%-ного этанола, перемешать.
12. Инкубировать при температуре -20°С 1-2 часа (лучше 12-14 часов).
13. Центрифугировать в течение 10 минут при 15000 об/мин.
14. К осадку добавить 80% раствор этанола, перемешать
15. Центрифугировать в течение 10 минут при
15000 об/мин.
16. Осадок высушить при комнатной температуре.
17. Добавить 50 мкл ТЕ буфера, перемешать, инкубировать при 56°С 12-14 часов в тер-мостате-шейкере. Центрифугировать 1 секунду.
18. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
19. Раствор ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
7. Выделение ДНК из пятен крови методом экстракции органическими реагентами
