Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Корниенко И.В. -> "Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел" -> 28

Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.

Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел — Ростиздат, 2001. — 256 c.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка): podgotovkabiologmateriala2001.djvu
Предыдущая << 1 .. 22 23 24 25 26 27 < 28 > 29 30 31 32 33 34 .. 53 >> Следующая

В определенных случаях, единственно доступным вещественным доказательством является зуб. В этом случае, для повышения эффективности экстракции ДНК, важно знать, в какой части зуба ее содержание максимально.
Зуб состоит из твердых и мягких тканей. В твердой части зуба различают эмаль, дентин и цемент; мягкая часть представлена так называемой пульпой (рис. 11).
Эмаль в основном состоит из неорганических солей, органическая же часть дентина представлена в основном коллагеном. Таким образом, ни дентин, ни эмаль практически не содержат ДНК. Цемент, покрывающий корень зуба и шейку, по химическому составу приближается к кости и содержит клетки — цементоциты.
Пульпа находится в коронковой полости зуба-и в корневых каналах. Она состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани, в которой имеются ядро-- и митохондриосодержащие клетки — дентинобласты.
Рисунок И. Дентин и пульпа зуба (по Елисееву В.Г., Афанасьеву Ю.И. и др., 1983).
I. — дентин; II. — предентин; III. — периферический слой пульпы; IV. — промежуточный слой пульпы; V — центральный слой пульпы.
1 — дентиновые канальца с отростками денти-нобластов; 2 — тела дентинобластов.
По сравнению с другими тканями организма зуб содержит очень мало ДНК, поэтому для него пробоподготовка должна проводиться отдельно от места, где находятся сухие ткани, оставшиеся на костях, или другой биологический материал,
содержащий большие количества ДНК. Такой биологический материал должен обрабатываться отдельно или после обработки материала, содержащего мало ДНК.
Ниже приводятся методы экстракции ДНК из костной ткани и зубной пульпы, которые нашли широкое применение на базе 124 ЦЛМКИ.
9. Выделение ДНК из костной ткани методом
органической экстракции
ПРИНЦИП:
Процедура включает этапы экстракции ДНК из костных останков и может быть использована для сухих костей без остатков тканей и костного мозга. Экстракция ДНК включает в себя лизис ядерных клеток в присутствии додецилсульфата натрия и протеиназы К. Для повышения эффективности экстракции ДНК в клеточный лизат вводят дополнительно реагенты-тиовосстановители, например дитиотрейтол или 2-меркаптоэтанол, которые разрушают дисульфидные белковые сшивки, дезорганизуя тем самым надмолекулярные клеточные ансамбли. Проводят очистку от фрагментов белков фенол/хлороформом, концентрирование раствора ДНК осуществляют при помощи концентратора Centricon 100.
ОБРАЗЕЦ:
Обычно 0,5 —2,5 грамма компактного вещества фрагмента трубчатой кости.
В компактном веществе кости практически вся ДНК локализована в остеоцитах, которые присутствуют в большом количестве (от 20000 до 26000 клеток/мм3 кости). ДНК, локализованная внутри компактного вещества кости, защищена от быстрой деградации, и поэтому можно легко получить микрограммовые ее количества из 1 г кости.
1. Перед процедурой экстракции обработать соответствующее оборудование, инструменты, рабочую поверхность стола и вытяжного шкафа следующим образом. Мельницы должны обрабатываться 0,5% ДТСКГ, стерильной дистиллированной водой и 96% этиловым спиртом в вытяжном шкафу или ПЦР-камере. Вытяжной шкаф, ПЦР-камера и другое оборудование необходимо обработать 7 мМ NaOCl. Обработанное оборудование должно быть тщательно высушено перед каждым использованием.
2. С поверхности фрагмента трубчатой кости с помощью скальпеля и жесткой щетки убрать остатки мышечной ткани и костного мозга. Почистить поверхности фрагмента кости наждачной бумагой, предварительно обработанной УФ светом. Вся процедура должна выполняться в стерильных резиновых перчатках и в маске.
3. Образец кости необходимо взвесить, записать. вес. Если вес костного фрагмента около 8 грамм или менее, то можно сразу приступать к его обработке. Если вес образца более 8 г, то его необходимо раздробить в металлической ступке из нержавеющей стали. Для этого необходимо обработать металлическую ступку и пестик активным хлорсодержащим раствором, тщательно смыть остатки дистиллированной водой, сушить ПЦР-камере при включенном ультрафиолете 30 минут. С помощью стального пестика раздробить костный фрагмент.
4. Полученные костные фрагменты взвесить. Часть костного материала упаковать и поместить на хранение.
5. Чистые костные осколки поместить в 50 мл ¦ коническую пробирку, содержащую примерно 25 мл стерильной деионизованной воды. Встряхивать не менее 10 раз. Воду слить.
6. п.5 повторить дважды.
7. В коническую пробирку с костными фрагментами добавить 96% этиловый спирт так, чтобы он покрыл образцы. Потрясти пробирку не менее 10 раз. Спирт декантировать.
8. п.7 повторить дважды.
9. Емкость для взвешивания обработать 7 мМ NaOCl и 96% этанолом, просушить и под-
писать. Из пробирки костные фрагменты высыпать на емкость для взвешивания и высушить на воздухе в ПЦР-камере или в ламинарном шкафу.
10. Обработать камеру и крышку мельницы для костей (осторожно, чтобы жидкость не затекала внутрь прибора) следующим образом: 10 секунд 7 мМ NaOCl, ополоснуть стерильной дистиллированной водой, затем 96% этанолом. Одноразовыми салфетками Кимвайп просушить остатки этанола.
Предыдущая << 1 .. 22 23 24 25 26 27 < 28 > 29 30 31 32 33 34 .. 53 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed