Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
анализа эритроциты не представляют интереса. Тем не менее, содержащийся в них гемоглобин и продукты его деструкции, вплоть до гемина, в присутствии молекулярного кислорода, являются потенциальными центрами радикалообразо-вания и ингибиторами Taq-полимеразы. Поэтому при выделении ДНК из крови необходимо большое внимание уделять степени очистки проб от геминовых дериватов.
Количество эритроцитов у взрослого мужчины колеблется от 3,9 до 5,5 млн. в 1 мкл, а у женщины — от 3,7 до 4,9 млн. в 1 мкл. Однако число эритроцитов у здоровых людей может
варьировать в зависимости от возраста, эмоциональной и мышечной нагрузки и др.
Рисунок 2. Форменные элементы крови
(по Елисееву В.Г., 1970).
1 — эритроцит; 2 — сегментоядерный нейтро-фильный гранулоцит; 3 — палочкоядерный ней-трофильный гранулоцит; 4 — юный нейтрофиль-ный гранулоцит; 5 — эозинофильный гранулоцит; 6 — базофильный гранулоцит; 7 — большой лимфоцит; 8 — средний лимфоцит; 9 — малый лимфоцит;
Щ
10 — моноцит; И — тромбоциты (кровяные пластинки).
Постэмбриональный эритропоэз протекает по схеме:
Стволовая клетка (содержит ядро и митохондрии) —* Полустволовая клетка (содержит ядро и митохондрии) —> Унипотентные предшественники (содержат ядро и митохондрии) —*¦ Базо-фильный проэритроцит (содержит ядро и митохондрии) —* Полихроматофильный проэритроцит (содержит ядро и митохондрии) —* Окси-фильный проэритроцит (содержит ядро, не содержит митохондрии) —*¦ Ретикулоцит (не содержит ядро и митохондрии) —>¦ Эритроцит (не содержит ядро и митохондрии).
Несмотря на то, что наряду со зрелыми эритроцитами в нормальной крови содержится 1 — 5% ретикулоцитов, эти клетки, вследствие отсутствия ядра и митохондрий (митохондрии редуцированы), также не представляют интереса для молекулярно-генетической идентификации личности.
Лейкоциты, или белые кровяные клетки, периферической крови весьма разнородны по морфологическим признакам. У взрослого человека их насчитывается 3800 — 9000 в 1 мкл. Количество лейкоцитов в сосудистом русле зависит от выраженности процессов их образования, скорости выхода (мобилизации) из костного мозга и перемещения в ткани (в особенности в
очаги повреждения), от степени захвата легкими и селезенкой. В силу этих и других причин содержание лейкоцитов в крови здорового человека подвержено определенным колебаниям: оно повышается к концу дня, при физической нагрузке, эмоциональном напряжении, резкой смене температуры окружающей среды, после приема пищи, теоретически даже положение руки в момент взятия крови из пальца может повлиять на количественные результаты экстракции ДНК.
В крови взрослого человека до 65-75% от общего состава лейкоцитов составляют нейтрофи-лы. Эти клетки содержат ядро, в их цитоплазме имеются все виды общих органелл, включая митохондрии.
Другая большая группа — агранулоциты, в большинстве своем представлена лимфоцитами, содержание которых в крови взрослых людей составляет 20-35%. Эти клетки также содержат ядро и несколько митохондрий.
Кровяные пластинки, или тромбоциты, представляют собой отделившиеся от гигантских клеток костного мозга — мегакариоцитов, безъядерные фрагменты цитоплазмы. Их количество в 1 мкл крови колеблется от 250 до 350 тысяч. Эти форменные элементы содержат 1-2 митохондрии, тем самым представляют интерес с точки зрения идентификации по прямым мат-рилинейным родственникам.
ПРИМЕР 4.
Оценить количество ядерной ДНК в 1 мкл крови человека.
Исходные данные: масса диплоидного генома равна Шдднк = 5,7 пг, содержание ядерных клеток в крови Сякл~ 8000 кл/мм3.
Получаем:
шяДНК|мкл = шяднк х Ся кл= 5,7 х 10'12 г х 8000 кл/мм3 ~
~ 4,6 х 10’8 г/мм3 = 46 нг.
Для проведения ПЦР по ядерным локусам
ф
необходимо в среднем 1-10 нг ДНК. Таким образом, 1 мкл крови теоретически достаточно для проведения 46-ти амплификаций.
ПРИМЕР 5.
Оценить минимальное количество митохондриальной ДНК в 1 мкл крови человека.
Основная масса митохондриального генома крови приходится на тромбоциты. Предположим, что среднее количество митохондрий на один лейкоцит равно 10, а в тромбоците содержится не менее 2-х митохондрий; в каждой митохондрии содержится до 10-ти молекул мтДНК.
Исходные данные: размер одной молекулы мтДНК равен 16569 п.н., количество молекул мтДНК тромбоцитах, исходя из вышеприведенного предположения, составляет как минимум Пмтднк = 20 молекул в одной клетке, в лейкоцитах — 100 молекул. Средняя концентрация тром-
боцитов в крови есть Ст ~ 300000 кл/мм3, лейкоцитов Сл ~ 8000 кл/мм3.
Вначале оценим массу одной молекулы мтДНК, для этого
для дт и гц х Nun. 615,5x16569 10 а.е.м.,
где 1 а.е.м. = 1,66x10'24 г.
ИЛИ ГПщтднк = 1,66х1017 г или 1,66х10‘5ПГ.
Затем вычисляем количество митохондриальной ДНК в 1 мкл крови:
т„тдмк X пмтдик X Ст = (1,66х 10'5х20х300000) +
+ (1,66х 10'5х 100x8000) ~ 110 пг.
Таким образом, минимальное количество митохондриальной ДНК в 1 мкл крови человека составляет 110 пг. Учитывая то, что для проведения сиквенс-анализа гипервариабельных регионов D-петли необходимо менее 100 молекул мтДНК, данного количества теоретически достаточно для постановки более чем 100 тысяч реакций ферментативной амплификации.
