Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
11. С помощью мельницы для костей получить костный порошок. Перенести костный порошок в стерильную, подписанную 15 мл пробирку.
12. На этом этапе выделение ДНК из костей можно остановить. Костный порошок можно хранить в прохладном, сухом, темном месте не более 5-ти дней. Для длительного хранения поместить пробирку с костным порошком на — 20°С.
13. К костному порошку добавить 3 мл гомогенного лизирующего буфера, 120 мкл 1М ДТТ, 200 мкл протеиназы К (10 мг/мкл). Перемешать.
14. Инкубировать 12-14 часов при 56°С при постоянном перемешивании, так, чтобы раствор не касался крышки пробирки.
15. После первого часа инкубации, пробирку тщательно встряхнуть и поменять крышку на стерильную, плотно закрыть.
16. На следующий день добавить 200 мкл про-теиназы К (10 мг/мкл).
17. Инкубировать 3 часа при 56°С при постоянном перемешивании.
18. Лизат центрифугировать при 3000 об/мин. 20 минут. Отделить супернатант в стерильную пробирку на 15 мл.
19. К супернатанту добавить 3 мл смеси фенол/ хлороформ/изоамиловый спирт (25 : 24 : 1). 5 секунд встряхивать на вортексе.
20. Центрифугировать при 3000 об/мин. в течение 20 минут. Перенести верхнюю водную фазу в стерильную 15 мл пробирку.
21. Повторить экстракцию смесью фенол/ хлороформ/изоамиловый спирт до тех пор, пока интерфаза на станет «чистой», или как минимум еще 2 раза.
22. К верхней водной фазе добавить 2 мл бу-танола. 5 секунд встряхивать на вортексе.
23. Центрифугировать при 3000 об/мин. 20 минут. Максимально отобрать верхнюю (бутанольную) фазу автоматической пипеткой или стерильной салфеткой Ким-вайп.
24. Дальнейшую очистку от ингибиторов и концентрацию раствора ДНК проводят с использованием устройства — концентратора Centricon 100.
25. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
26. Водный раствор ДНК хранить при температуре + 4°С в течение 3-х недель, при — 70°С неограниченно долго. Во избежание разрушения молекул ДНК свободными радикалами длительное хранение водных растворов ДНК при — 20°С нежелательно.
10. Выделение ДНК из декальцинированной костной ткани методом органической
экстракции
ПРИНЦИП:
Процедура включает этапы экстракции ДНК из костных останков без остатков тканей и костного мозга. Первый этап экстракции включает в себя стадию декальцинирования костной стружки, затем дальнейший лизис ядерных клеток в присутствии додецилсульфата натрия, дитиот-рейтола и протеиназы К. Проводят очистку от белков смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. Концентрирование раствора ДНК осуще-*
ствляют при помощи устройства — концентратора Centricon 100.
ОБРАЗЕЦ:
Обычно 0,5 —2,5 грамма компактного вещества фрагмента трубчатой кости.
1. Перед процедурой экстракции обработать соответствующее оборудование, инструменты, рабочую поверхность стола и вытяжного шкафа следующим образом. Мельницы должны обрабатываться 0,5% ДТСКГ, стерильной дистиллированной водой и 96% этиловым спиртом в вытяжном шкафу или ПЦР-камере. Вытяжной шкаф, ПЦР-камера и другое оборудование необходимо обработать 7 мМ NaOCl. Обработанное оборудование должно быть тщательно высушено перед каждым использованием.
2. Провести пробоподготовку, как описано выше (метод 9, пп. 2-10).
3. С помощью мельницы для костей получить костный порошок. Перенести костный порошок в стерильную подписанную пробирку объемом 15 мл.
4. На этом этапе выделение ДНК из костей можно остановить. Костный порошок можно хранить в сухом, прохладном, темном месте не более 5-ти дней. Для длительного хранения поместить пробирку с костным порошком на — 20°С.
5. Поместить 1 г костного порошка в 15 мл пробирку, если 3 г — то в 50 мл коническую пробирку.
6. Для декальцинирования пробирку с костной стружкой заполнить стерильным 0,5 М раствором ЭДТА (pH 7,5). Инкубировать
24 часа при + 4°С при покачивании.
7. Центрифугировать 15-30 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость слить. П.6 повторить 4-5 раз.
8. Декальцинированный осадок костной ткани ресуспендировать в стерильной деионизованной воде.
9. Центрифугировать при 3000 об/мин. в течение 15-30 минут.
10. Супернатант слить.
11. пп. 9-10 повторить дважды.
12. К осадку добавить 2 мл лизирующего буфера, 200 мкл 1 М ДТТ, 200 мкл протеина-зы К (10 мг/мкл). Перемешать.
13. Инкубировать 12-14 часов при 56°С при постоянном перемешивании, так, чтобы раствор не касался крышки пробирки.
14. Лизат центрифугировать при 3000 об/мин. 30 минут. Отделить супернатант в стерильную пробирку на 15 мл.
15. К супернатанту добавить равный объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1). 5 секунд встряхивать на вортексе.
16. Центрифугировать при 3000 об/мин. в течение 20 минут.
17. Перенести верхнюю водную фазу в стерильную 15 мл пробирку.
18. Повторить экстракцию смесь фенол/хлороформ/изоамиловый спирт до тех пор, пока интерфаза не станет «чистой», или, как минимум, еще 2 раза.
19. К верхней водной фазе, добавить 2 мл бу-танола. 5 секунд встряхивать на вортексе.