Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
+5°С. Это одна из наиболее подходящих для хранения ДНК температур.
— 20°С. При этой температуре происходит интенсивное образование одно- и двухцепочечных разрывов. Соль в растворах ДНК вымораживается, а точка замерзания насыщенного раствора соли примерно соответствует тем температурам, которые получаются в большинстве морозильных камер при их циклической работе. В результате ДНК подвергается многократным циклам замораживания — оттаивания.
— 70°С. Это, по-видимому, лучшая температура для длительного хранения. Однако, в замороженном состоянии повреждающее действие свободных радикалов может быть гораздо выше.
Хранить ДНК в течение длительного времени лучше всего в растворах с высокой концентрацией соли (> 1 М), высокой концентрацией Na2~ ЭДТА (>10 мМ) при pH 8,5 (трис-буфер). Очень хорошо хранить ДНК в растворе CsCl с бромистым этидием, плотность которого соответствует плавучей плотности ДНК, при 5°С в темноте (завернув сосуд в алюминиевую фольгу). При этих условиях за год происходит разрыв примерно одной фосфодиэфирной связи на 200 тыс. н.п. ДНК.
Очень удобно хранить биологический образец, содержащий ДНК (как правило, кровь), на FTA-картах. Временные исследования с использованием FTA-карточек начались с 1989 года. Полученные результаты показывают, что амплификация ДНК, иммобилизованной на необработанных карточках, может оказаться неудачной уже в течение первых 6 мес. хранения. Успешная амплификация ДНК, иммобилизованной на карточках, обработанных FTA, была осуществлена и после более чем 6-летнего хранения (табл. 3).
Стабильность образцов ДНК при хранении может быть повышена при помещении FTA-карточки в мульти-барьерный пакет Fitzco, состоящий из семи слоев, включая слои фольги, полиэфира, бумаги и полиэтилена; для уменьшения влажности внутрь конверта помещают пакетик с силикагелем. Эта система упаковки позволяет сохранить целостность ДНК путем
предохранения образца крови от воздействия озона, ультрафиолетового излучения и изменений влажности. Комбинация FTA-карточки и усовершенствованной упаковки позволяет полностью устранить необходимость хранения образца крови при низкой температуре.
Таблица 3.
Хранение ДНК, иммобилизованной на FT А, при различных условиях внешней среды
Условия Необрабо Материал,
хранения танный обработанный
материал FTA
--- 81°С в течение -J---Ь (а&Ь) Н---1---h (а&Ь)
6 мес.
Комнатная темпе -(а&Ь) + + + (а&Ь)
ратура, на свету в
течение 6 мес.
Комнатная темпе --- (а&Ь) Н---1---Ь (а&Ь)
ратура, в темноте
в течение 6 мес.
Комнатная темпе --- (а, Ь&с) + + + (а, Ь&с)
ратура, в темноте
в течение 4,5 лет
Комнатная темпе -(а, Ь&с) Н---1---I- (а, Ь&с)
ратура, в темноте
в течение 6,5 лет
Примечания:
(а) = D17S5 мик- + + + очень хорошо различи-
росателлит мый на геле ПЦР-продукт
(b) = МБР микросателлит
(c) = HLA DQ-
альфа
+ + хорошо различимый ПЦР продукт
4- едва различимый ПЦР-продукт
— ПЦР-продукт не различим
Компьютерное обеспечение учета биологического материала
В депозитарии экспертного центра, работающего не первый год, могут содержаться десятки тысяч образцов биологических тканей и соответствующих им препаратов выделенной суммарной ДНК. Каждый образец должен иметь свой паспорт. Паспорт биологической пробы — это совокупность информации, отражающая код пробы, к какому экспертному случаю она имеет отношение, количество пробы, ее состояние, время и место отбора пробы, персоналии экспертов, работавших с пробой и указанием оснований для производства работ, краткие технические результаты проведенного исследования.
Исходя из вышесказанного, становится актуальной проблема создания реестра (списка) ДНК-содержащих проб и выделенной ДНК. Изначально реестр должен вестись как в виде бумажной картотеки на твердых носителях (для гарантии доступа к реестру в случае отключения электроэнергии или необратимой потери информации в электронном виде), так и в элек-
тронном виде путем создания компьютерной базы данных. Безусловно, компьютерная база данных реестра проб имеет неоспоримые преимущества с точки зрения скорости доступа к электронной базе данных, возможности организации оперативных выборок по интересующему признаку или признакам и т.п.
Компьютерная база данных — это программный продукт, который должен отвечать следующим базовым критериям:
1. Компьютерная база данных должна обеспечивать возможность ведения электронного каталога проб без ухудшения качества работы в пределах 106 наименований проб.
2. Программа должна обеспечивать возможность ведения паспортных характеристик образцов с выборкой по интересующему признаку.
