Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
печить отсутствие яркого прямого солнечного света, низкую влажность и невысокую температуру. Лучше, если пробы будут храниться в пакетах типа Fitzco.inc в холодильниках при +4°С.
Хранение образцов выделенной ДНК
Для подавляющего большинства экспертных работ при ДНК-типированияи личности применяют препараты суммарной ДНК, выделенные из различных тканей. При этом имеется в виду, что в препарате суммарной ДНК могут содержаться фракции, как высокомолекулярной ядерной, так и митохондриальной ДНК. При проведении экспертных работ, как правило:
1. Выделяется количество суммарной ДНК, значительно превышающее ее количество, требующееся для текущего анализа;
2. При выделении ДНК образец необратимо разрушается и, как правило, не может быть получен повторно.
3. Препараты выделенной ДНК не являются патогенными, в отличие от биологических тканей и образцов цельной крови, поэтому работать с ними намного удобнее, проще и безопаснее.
Всё это создает существенные предпосылки для организации еще одного отделения депозитария — депозитария образцов выделенной ДНК. Организация отделения депозитария об-
разцов выделенной ДНК позволяет осуществлять выборочный мониторинг качества экспертных оценок, ускорить и существенно удешевить повторную ре-идентификацию образцов, расширить количество методических подходов, используемых в работе.
При хранении образцов выделенной ДНК используются классические методические приемы (см. ниже). При поступлении препаратов выделенной ДНК в депозитарий должны быть четко указаны в сопроводительных документах:
1. Шифр образца, из которого экстрагировалась ДНК.
2. Время проведения работ, подробный протокол экстракции ДНК.
3. Техническая информация с фотографиями, характеризующими состояние ДНК (степень ее фрагментации), концентрацию или количество ДНК в образце с указанием метода, по которому проводилось количественное определение.
4. Данными об эксперте, проводившем экстракцию, и основание для проведения работ
5. Метод консервации, использованный для препарата ДНК.
Препараты образцов выделенной ДНК должны храниться в отдельном непроходном помещении, с моющимися полом и стенами, в холодильных установках. В отличие от образцов цельной крови и биологических проб (фрагменты тканей), препараты выделенной ДНК не яв-
ляются патогенными. При работе с ними степень биологической опасности не столь высока. При выборе метода хранения проб ДНК следует помнить, что наименее стабильны растворы ДНК (их необходимо замораживать или хранить при +4°С), более стабильны препараты выделенной ДНК в сухом виде на твердых носителях (типа FTA-карт) и наиболее стабильны лиофиль-но высушенные препараты ДНК. В любом случае, не рекомендуется держать препараты выделенной ДНК на открытом солнечном свету, в условиях повышенной влажности, в непосредственной близости от источников ультрафиолетового излучения или активных форм кислорода.
Факторы, влияющие на хранение нуклеиновых кислот
Соединения, содержащие в своем составе ионы металлов переменной валентности (например, ионы железа (II), железа (III), меди (II)), являются потенциальными центрами радикало-образования, и способствуют разрушению нуклеиновых кислот.
Ыа2-ЭДТА прекрасно хелатирует ионы тяжелых металлов, предотвращая инициацию свободнорадикальных процессов.
При радиоактивном облучении и в результате химического расщепления образуются свобод-
ные радикалы. Они вызывают разрывы фосфо-диэфирных связей.
При аутоокислении липидов, вследствии образования пероксильных радикалов, ускоряется образование 8-гидроксигуанина, что может существенно сказаться на результатах сиквенс-анализа ДНК.
УФ-лучи. Облучение светом с длиной волны 260 нм вызывает различные повреждения, в том числе приводит к образованию тиминовых димеров и поперечных сшивок. Облучение светом с длиной волны 320 нм также вызывает образование поперечных сшивок, но с меньшей эффективностью.
Диэтилпирокарбонат и диэтилоксидифор-мат. Эти соединения могут вызывать потерю биологической активности нуклеиновых кислот. С двухцепочечными нуклеиновыми кислотами они, как правило, не реагируют при комнатной температуре.
Низкие значения pH вызывают депуриниза-цию (этот процесс характеризуется высокой энергией активации).
Бромистый этидий вызывает фотоокисление ДНК при облучении ее видимым светом в присутствии молекулярного кислорода. Он хорошо захватывает свободные радикалы.
Фенол. Продукты его окисления могут вызывать разрывы фосфодиэфирных связей.
Эфир. Перекиси вызывают, по-видимому, разрывы фосфодиэфирных связей.
Формамид. Большинство водных растворов формамида со временем закисляется (до pH 5). Поскольку процесс катализируется щелочью, то лучше забуферить раствор формамида около pH 7 с помощью фосфата. Если РНК находится в формамиде дольше нескольких дней, то в ней обнаруживается некоторое количество разрывов фосфодиэфирных связей.
Этанол. В отсутствие тяжелых металлов этанол не вызывает повреждений ДНК.
Нуклеазы. У людей на кожном покрове присутствуют нуклеазы. Поэтому старайтесь, чтобы пальцы не приходили в прямой или опосредованный контакт с нуклеиновыми кислотами. В большинстве своем ДНК-азы по сравнению с РНКазами менее устойчивы.
