Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
23. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. Херрингтона С., Макги Дж. — М.: Мир, 1999. — 558 с.
24. Касьяненко Н.А., Бартошевич С.Ф., Фрис-ман Э.В. Исследование влияния pH среды на конформацию молекулы ДНК // Молекулярная биология, 1985. — Т. 19. — С. 1386-1393.
25. Belgrader P., Del Rio S.A., Turner К.А., Marino M.A., Weaver K.R., Williams P.E. Automated DNA Purification and Amplification for Blood-
Stained Cards Using a Robotic Workstation // BioTechniques, 1995. — Vol 19. — P. 426-432.
26. Balasubramanian B., Pogozelski W.K., Tullius T.D. DNA strand breaking by the hydroxyl radical is governed by the accessible surface areas of the hydrogen atoms of the DNA backbone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998.-Vol. 95.-P. 9738-9743.
27. Alexander P., Lett J.T. Role of oxygen in the cross-linking and degradation of deoxyribonucleic acid by ionizing radiations // Nature, 1960. - Vol. 187. - P. 71-72.
28. Martini М., Termini J. Peroxy radical oxidation of thymidine // Chemical Research in Toxicology, 1997. - Vol. 10. - P. 234-241.
29. Rodriguez H., Valentine M.R., Holmquist G.P., Akman S.A., Termini J. Mapping of peroxyl radical induced damage on genomic DNA // Biochemistry, 1999.—Vol. 38. —P. 16578-16588.
30. Burgoyne L., Kijas J., Hallsworth P., Turner J. Safe collection, storage and automated analysis of DNA from blood // An abstract/adaption from the contents of a poster presented to the 5th International Symposium on human identification October 8-11, 1994, Scotsdale Arizona, USA. Last updated Feb 1996.
31. Burgoyne L.A. US patent. Solid medium and method for DNA storage. Serial number 5,496,562, 1996.
МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ ДНК
Чтобы иметь возможность провести молекулярно-генетический анализ ДНК, нужно прежде всего получить ее в чистом виде. Типичная диплоидная клетка человека в норме содержит около б пг геномной и разное количество митохондриальной ДНК. Тотальная ДНК, экстрагируемая из биологических образцов, представляет собой смесь ядерной и митохондриальной ДНК. Выделение ядерной ДНК возможно только через выделение и очистку клеточных ядер. Однако, как показывает практика, присутствие митохондриальной ДНК не мешает проведению ПЦР с использованием праймеров, специфичных для локусов ядерной ДНК, и наоборот.
Для выделения суммарной фракции ДНК разрушают плазматическую, ядерную и митохондриальные мембраны и освобождаются от белков. Один из широко используемых методов получения чистых препаратов нативной ДНК, не содержащих белков, заключается в деструкции тканей и клеток анионными детергентами типа додецилсульфата натрия с последующим отделением белков в виде осадка, при сохранении нуклеиновой кислоты в растворе. Далее ДНК выделяют осаждением в этаноле солевого раствора нуклеиновой кислоты, или концентрированием исходного раствора, пропуская его через
специальную колонку-концентратор мембранного типа (например, Centricon 100, Amicon, США).
В зависимости от задач можно использовать несколько методов очистки ДНК, включая традиционную очистку с использованием органических реагентов. Этот метод предназначен для получения свободных от белка нуклеиновых кислот в высокополимерном состоянии. В зависимости от кислотности водонасыщенного фенола можно получить в чистом виде, как ДНК, так и РНК. Фенол денатурирует белки, эффективно подавляя активность рибо- и дезоксирибонуклеаз и предотвращает деполимеризацию нуклеиновых кислот.
Метод очистки ДНК с использованием органических реагентов может успешно применяться при ДНК-дактилоскопии, тогда как для ферментативной амплификации эта методика не всегда является достаточной. Основной причиной является недостаточно полная очистка ДНК при спиртовом осаждении от ингибиторов ПЦР-реакции, таких как гем. Последующий диализ проб либо замена этапа спиртового осаждения концентрированием раствора ДНК на колонках типа Centricon 100 позволяют провести наиболее полную очистку ДНК. Существуют несколько методов неорганической экстракции с использованием высоких концентраций солей, суспензии силикагеля для получения препаратов высокомолекулярной ДНК. К сожалению, все эти методы состоят из нескольких этапов, реализация
которых требует больших временных затрат, а также методов многократного переноса образцов из одной пробирки в другую, что, несомненно, увеличивает вероятность контаминации образцов.
Напротив, экстракция с использованием анионообменной смолы Chelex 100 (Bio Rad, США) не требует большого времени и выполняется в одной пробирке, что существенно снижает риск загрязнения препаратов ДНК. Однако ДНК, очищенная с помощью Chelex 100, является одноцепочечной, и поэтому оценить ее количество при помощи методов, где используются интеркалирующие красители, например, бромистый этидий, трудно. Кроме того, Chelex 100 практически не может использоваться для экстракции ДНК из древних костных останков.
Подготовка рабочего места и инструментария
1. Во избежание контаминации все этапы этой процедуры должны выполняться в соответствующей ПЦР-камере или ламинарном шкафу.
