Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) в крови. Принцип. Глутатионредуктаза (ГР), используя восстановленные формы пиридиннуклеотидов, переводит окисленную форму глутатиона в восстановленную. По степени увеличения количества восстановленного глутатиона в среде инкубации рассчитывают активность фермента.
Реактивы: 0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4. 6,8 г KH2PO4 растворяют в 500 мл дистиллированной воды, 11,4 г K2HPO4 • 3H2O — в 500 мл воды и смешивают полученные растворы под контролем pH-метра до получения необходимого pH;
4,0 ммоль/л раствор окисленного глутатиона. 134,75 мг окисленного глутатиона и 0,5 мг ЭДТА-Na растворяют в 55 мл фосфатного буфера, pH 7,6. Раствор готовят в день исследований;
5,35 ммоль/л раствор НАДФ • H2. 11,16 мг НАДФ • H2 растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды. Раствор готовят перед использованием;
10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты: 10 г ТХУ растворяют в 90 мл дистиллированной воды;
0,3 моль/л раствор фосфатного буфера, pH 8,0. 10,2 г KH2PO4 растворяют в 250 мл дистиллированной воды, 34,2 г K2HPO4 х X 3H2O — в 500 мл воды и смешивают полученные растворы под контролем pH-метра до получения необходимого pH;
10,0 ммоль/л раствор реактива Эллмана: 39,6 мг 5,5-ди-тио-бис-(2-нитробензойной) кислоты растворяют в 10 мл абсолютного метилового спирта.
Оборудование: спектрофотометр; центрифуга рефрижераторная; баня водяная; холодильник бытовой; весы аналитические; pH-метр; секундомер; пипетки измерительные; пробирки химические и центрифужные; колбы мерные.
Ход определения. В химические пробирки наливают по 0,5 мл крови и добавляют по 3,5 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и ставят в холодильник на 10—15 мин для полного гемолиза. В такие же пробирки вносят по 2 мл раствора окисленного глутатиона, прибавляют по 1 мл гемолизата крови и хорошо перемешивают. По 1 мл полученной смеси переносят в две центрифужные пробирки, помещают их в водяную баню при 37 °С и инкубируют в течение 5 мин. В опытную пробирку добав-
180
ляют 0,1 мл раствора НАДФ • H2, интенсивно встряхивают и оставляют в водяной бане. Ровно через 10 мин (по секундомеру) в опытную и контрольную пробирки приливают по 1 мл холодного 10%-ного раствора ТХУ. В контрольную пробирку только после этого добавляют 0,1 мл раствора НАДФ • H2. Обе пробирки встряхивают и помещают на 10 мин в холодильник. Пробы центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин 1 и 0—4 °С.
По 1 мл надосадочной жидкости из контрольной и опытной пробирок переносят в отдельные химические пробирки и приливают по 5 мл фосфатного буфера, pH 8,0. Затем в обе пробирки прибавляют по 0,05 мл реактива Эллмана и содержимое тщательно перемешивают.
Измеряют оптическую плотность контрольной пробы по сравнению с опытной в кювете с ходом луча 10 мм при 412 нм. Расчет активности ГР производят по формуле
А= ?¦6,05- IQ6- 84 13100 10-2 '
где А — активность фермента, мкмоль окисленного глутатиона/л • 5 мин, E — оптическая плотность; 6,05 — конечный объем пробы; 10° — коэффициент пересчета в мкмоль/л; 84 — фактор разведения крови; 13 100 — коэффициент малярности экстинкции ТНФА; 10 — время инкубации, мин; 2 — коэффициент пересчета на окисленный глутатион.
Клиническое значение. Наибольшая активность ГР обнаружена в почках, тонком кишечнике, эритроцитах. Играет важную роль в поддержании достаточного уровня восстановленного глутатиона (GSH) из окисленной его формы (GSSG), что позволяет обеспечить функционирование глутатионзависимых анти-пероксидантных систем. В качестве донора водорода для восстановления окисленного глутатиона главным образом используется НАДФ, но может быть использована и НАДН. Активность ГР существенным образом зависит от обеспеченности рибофлавином.
Повышение активности ГР отмечается на фоне повышения процессов ПОЛ, в частности при хроническом заболевании печени. Активность ГР в крови животных колеблется от 150 до 450 мкмоль окисленного глутатиона/л • мин.
Источники: 11, 37, 41.
Определение восстановленного глутатиона в крови. Принцип. Сульфгидрильная группа восстановленного глутатиона вступает в реакцию с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой (реактив Эллмана), в результате чего в эквимолярных количествах образуется окрашенный в желтый цвет тионитрофенильный анион (ТНФА), имеющий максимум поглощения при 412 нм.
Реактивы: 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);
0,3 моль/л фосфатный буфер, pH 8,0: 10,2 г KH2PO4 растворяют в 250 мл дистиллированной воды и 34,2 г K2HPO4 • 3H2O — в
181
500 мл дистиллированной воды. В раствор двузамещенного фосфорнокислого калия под контролем pH-метра приливают раствор однозамещенного фосфорнокислого калия до установления pH 8,0;
10,0 моль/л раствор реактива Эллмана: 39,6 мг 5,5-ди-тио-бис-(2-нитробензойной) кислоты растворяют в 10 мл абсолютного метилового спирта.
Оборудование: спектрофотометр; центрифуга рефрижераторная; весы аналитические; холодильник бытовой; пипетки измерительные; пробирки центрифужные и химические.
Ход определения. В химические пробирки наливают по 0,5 мл гепаринизированной крови, 3,5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают для лучшего гемолиза. Затем по 2 мл разведенной в 8 раз крови переносят в центрифужные пробирки и приливают к ним по 1 мл 20%-ного раствора ТХУ. Пробы тщательно перемешивают и оставляют в холодильнике на 15—20 мин. Затем их центрифугируют 15 мин при 3000 мин 1 и температуре 0—4 °С.
