Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9)
в крови. Принцип. Глутатионпероксидаза (селенсодержащий фермент), восстанавливая гидропероксиды, окисляет восстановленный глутатион (H2O2 + G-SH -> 2H2O2 + G-S-S-G), по уменьшению которого в среде инкубации определяется активность фермента.
Реактивы: 0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4. Для этого 6,8 г KH2PO4 растворяют в 500 мл дистиллированной воды, 11,4 г K2HPO3 • 3H2O в 500 мл воды и смешивают полученные растворы под контролем pH-метра до необходимого pH;
31,88 ммоль/л раствор восстановленного глутатиона. 24,29 мг восстановленного глутатиона, 14,52 мг натрия азида и 27,68 мг ЭДТА-Na растворяют в 35 мл фосфатного буфера, pH 7,4. Раствор готовят непосредственно перед исследованиями;
13,8 ммоль/л раствор пероксида водорода. На титрование такого раствора должно идти 6,96 мл 1 н. раствора KMnO4. По результатам титрования раствор пероксида водорода доводят водой до необходимой концентрации;
10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты: 10 г ТХУ растворяют в 90 мл дистиллированной воды;
0,3 моль/л фосфатный буфер, pH 8,0: 10,2 г KH2PO4 растворяют в 250 мл воды, 34,2 г K2HPO4 • 3H2O в 500 мл воды, под контролем pH-метра растворы смешивают до необходимого pH;
10,0 ммоль/л раствор Эллмана: 39,6 мг 5,5-дитио-бис-(2-нитро-бензойной) кислоты растворяют в 10 мл абсолютного метилового спирта.
Оборудование: спектрофотометр; центрифуга рефрижераторная; баня водяная; холодильник бытовой; весы аналитические; секундомер; pH-метр; колбы мерные; пробирки химические и центрифужные; пипетки измерительные.
Ход определения. В химические пробирки наливают по 0,5 мл гепаринизированной крови и добавляют по 3,5 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и оставляют в холодильнике на 10—15 мин для более полного гемолиза. В другие химические пробирки вносят по 1 мл раствора глутатиона и прибавляют по 1 мл гемолизата. Затем по 0,5 мл смеси переносят в две центрифужные пробирки, помещают их в водяную баню при 37 °С
178
и инкубируют в течение 5 мин. В первую пробирку (опытную) добавляют 0,1 мл раствора пероксида водорода, интенсивно встряхивают и оставляют в водяной бане. Ровно через 1 мин после этого (по секундомеру) в опытные и контрольные пробы приливают по 2 мл холодного 10%-ного раствора ТХУ. В контрольные пробирки только после этого добавляют 0,1 мл раствора H2O2.
Обе пробирки встряхивают и помещают на 10 мин в холодильник. Затем пробирки центрифугируют при 3000 мин 1 и 0—4 °С в течение 15 мин. По 0,5 мл надосадочной жидкости из опытной и контрольной пробирок переносят в химические пробирки и приливают в них по 10 мл фосфатного буфера, pH 8,0. В обе пробирки прибавляют по 0,05 мл реактива Эллмана, содержимое тщательно перемешивают.
Измеряют оптическую плотность контрольной пробы по сравнению с опытной в кювете с ходом луча 10 мм при 412 нм.
Для определения скорости неферментативного окисления восстановленного глутатиона исследуют пробы, в которые вместо гемо-лизата прибавляют 1 мл воды (далее как описано выше) (см. с. 177).
Расчет активности глутатионпероксидазы крови проводят по формуле
(E0-Ex)- 10,55- IQ6- 166,4
ГзШ '
где А — активность фермента, ME [мкмоль восстановленного глутатиона/л • мин]; E0 — оптическая плотность контрольной пробы по сравнению с опытной при неферментативном окислении глутатиона; E^ — оптическая плотность контрольной пробы по сравнению с опытной при неферментативном окислении глутатиона; 10,55 — конечный объем пробы; 106 — пересчет в мкмоли; 166,4 — фактор разведения; 13 100 — коэффициент малярной экстинкции тионитрофенильного аниона (ТНФА), образующегося после окисления 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислоты, входящего в состав раствора Эллмана.
Примечания. 1. Исследование необходимо проводить возможно быстрее после взятия крови. 2. Реактив Эллмана необходимо приливать к буферу после внесения в него супернатионата как можно быстрее. Клиническое значение. Глутатионпероксидазе принадлежит ведущее место в ферментативном звене антиоксидант-ной защиты организма. Она катализирует превращение пероксида водорода и органических пероксидов до гидросоединений, которые в дальнейшем могут метаболизироваться клеточными системами. В одной молекуле фермента содержится четыре атома селена. В организме животных обнаружена глутатионпероксидаза (ГПО-2), не содержащая селена, которая имеет субстратное родство только к органическим пероксидам. Селенсодержащая глутатионпероксидаза (ГПО-1) предотвращает продолжение процесса ПОЛ, обезвреживая уже образовавшиеся гидропероксиды жирных кислот, и одновременно предупреждает их образование. Под ее влиянием восстановленный глутатион реагирует с пероксидом водорода и пре-
12*
179
вращается в окисленный, который при участии фермента глутатионредуктазы вновь переходит в восстановленный. Активность глутатионпероксидазы зависит не только от интенсивности процесса ПОЛ, но и от обеспеченности организма селеном: нормально сбалансированные по селену рационы поддерживают активность фермента на стабильно высоком уровне. Недостаток, наоборот, снижает его активность. В среднем активность глутатионпероксидазы в крови животных колеблется от 8 до 20 мкмоль G-SH/л • мин • 103. Источники: 11,41.
