Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кондрахин И.П. -> "Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики" -> 86

Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.

Кондрахин И.П., Архипов А.В., Левченко В.И., Таланов Г.А., Фролова Л.А., Новиков В.Э. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики: Справочник. Под редакцией Сайтаниди В.Н. — М.: Колос, 2004. — 520 c.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка): metodvetkllabdia2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 246 >> Следующая


В две химические пробирки наливают по 0,5 мл фосфатного буфера и в каждую добавляют по 1 мл надосадочной жидкости. В опытную пробирку приливают 0,05 мл раствора Эллмана, а в контрольную — 0,05 мл метанола. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Измеряют оптическую плотность обеих проб против фосфатного буфера в 10-миллиметровой кювете при длине волны 412 нм.

Концентрацию восстановленного глутатиона рассчитывают по формуле

C= Е°~Е\ •72,6•1O3, 13,1 103

где С — содержание восстановленного глутатиона, ммоль/л; E0 — оптическая плотность опытной пробы; Ек — оптическая плотность контрольной пробы; 13,1 • 103 — коэффициент малярной экстинкции ТНФА при 412 нм; 72,6 • 103 — фактор разведения.

Примечания. 1. Исследование крови необходимо проводить в максимально короткие сроки после ее взятия. 2. Реактив Эллмана следует приливать к буферу как можно быстрее после внесения в него надосадочной жидкости. Клиническое значение. Глутатион представляет собой серосодержащий триплет, состоящий из трех аминокислот — глутаминовой, цистина и глицина. Содержится во всех живых организмах и играет важную роль в окислительно-восстановительных реакциях. В организме он присутствует главным образом в восстановленной форме (G-SH), тогда как на долю окисленной формы (G-SS-G) приходится 1—3 % общего его содержания. Глутатион — главный фонд мобильных сульфгидрильных групп, а также он участвует в транспорте аминокислот, обмене дисульфидов и поддержании сульфгидрильных групп белков в восстановленном CO-

182

стоянии. Как серосодержащее соединение глутатион участвует в реакции с гидропероксидами без участия каких-либо ферментов или катализаторов. Может ингибировать ПОЛ на уровне инициирования цепного процесса и способен реагировать со свободными радикалами так же активно, как а-токоферол.

Содержание восстановленного глутатиона в крови животных колеблется от 0,4 до 0,7 ммоль/л, в том числе у кур от 0,6 до 0,8 ммоль/л. На уровень глутатиона в крови влияет обеспеченность животных серосодержащими аминокислотами и серой. Его повышение в крови свидетельствует о выраженной защитной и детоксирую-щей силе организма.

Источники: 11, 17.

Определение витамина Ев сыворотке крови (см. с. 195).

Определение церулоплазмина в сыворотке крови. Принцип. Метод основан на регистрации оптической плотности при 520 нм окрашенных продуктов, образующихся при ферментативном окислении церулоплазмином солянокислого парафенилендиамина.

Реактивы: 0,4 моль/л ацетатный буфер, pH 5,5. 54,4 г натрия ацетата (C^COONa • 3H2O) растворяют в 900 мл дистиллированной воды, доводят pH до 5,5 под контролем pH-метра концентрированной уксусной кислотой и объем доводят водой до 1 л. Хранят в холодильнике несколько месяцев;

1,5%-ный раствор калия роданида;

буферно-субстратная смесь: 10 мг парафенилендиамина гидрохлорида растворяют в 20 мл ацетатного буфера, pH 5,5. Готовят в день проведения анализов;

10 ммоль/л раствор бензохинона. 10,8 мг бензохинона, высушенного в эксикаторе до постоянной массы, растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; баня водяная; секундомер; весы аналитические; пробирки химические; пипетки с делениями разные.

Ход определения. В две пробирки вносят по 0,1 мл сыворотки крови, приливают по 1 мл буферно-субстратной смеси и инкубируют в водяной бане при 37 °С в течение 5 мин. Не вынимая пробирок из водяной бани, в одну из них (контрольную) приливают 2 мл охлажденного до 0—4 °С раствора калия роданида. Ровно через 10 мин (по секундомеру) приливают во вторую (опытную) пробирку 2 мл охлажденного раствора калия роданида и обе пробирки вынимают из бани.

Измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 530 нм в кюветах с ходом луча 10 мм или на ФЭКе с зеленым фильтром.

Для построения калибровочного графика из свежеприготовленного раствора бензохинона концентрацией 10 ммоль/л готовят разведения стандартных растворов в интервале концентраций от 0,5 до 5,0 ммоль/л. Затем к 0,1 мл каждого стандартного раствора

183

добавляют по 1 мл буферно-субстратной смеси и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. После этого в пробы добавляют по 2 мл раствора калия роданида и измеряют оптическую плотность при 530 нм на спектрометре или ФЭКе. В качестве раствора для сравнения используют смесь из 0,1 мл воды, 1 мл ацетатного буфера и 2 мл раствора калия роданида. На бумаге с миллиметровыми делениями строят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс значения концентраций стандартных растворов, а по оси ординат — соответствующие им значения оптической плотности.

Ферроксидазную активность церулоплазмина рассчитывают по формуле

А = X/t,

где А — активность церулоплазмина, мкмоль/л бензохинона/л ¦ мин; X — количество бензохинона, найденное по калибровочной кривой, ммоль/л; / — разница времени инкубации контрольной и опытной проб, мин (10 мин).

Примечания. 1. Сыворотка крови должна быть без гемолиза.

2. Сыворотку можно хранить в течение 1 нед при температуре 0—4 °С. Клиническое значение. Церулоплазмин (феррок-сидаза КФ 1.16.3.1) — медьсодержащий белок, который в крови, подобно супероксиддисмутазе (СОД), катализирует реакцию дис-мутации (превращения) свободнорадикальных форм кислорода
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 246 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed