Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
/ Z U В 12 Jfffffifffffmpanusf cma/f&apma
Рис. 8.5. Повышение чувствительности радиоиммунологического анализа путем добавления меченого лнгаида не до» а после добавления антитела (анализ плацентарного лактогеиа человека). /—меченый лнгаид добавлен перед добавлением антитела, II — меченый лиганд добавлен . после добавлении антитела.
6 Т. Чард
8.2.6. Очистка связывающего агента
Выше уже обращалось внимание на гетерогенность популяции антител в любой антисыворотке, и на первый взгляд может показаться желательным отобрать для использования в анализе только те антитела, которые обладают наибольшим сродством. Такой отбор можно осуществить путем предварительной обработки антисыворотки иммуносорбентом; в этом случае в более мягких условиях будут элюироваться молекулы антител, обладающие низким сродством, а в более жестких условиях — молекулы, обладающие высоким сродством. В техническом отношении такой способ очистки антисыворотки обладает рядом потенциальных недостатков: 1) для приготовления иммуносорбента требуется значительное количество чистого антигена; 2) из-за низкого выхода приходится расходовать много антисыворотки; 3) метод отнимает много времени и требует высокой квалификации; 4) в условиях, при которых проводится элюция молекул антител, обладающих высоким сродством (т. е. диссоциация комплекса), может наблюдаться их повреждение. Более важным обстоятельством является отсутствие уверенности в том, что таким путем действительно можно добиться ожидаемого эффекта, а именно повышения чувствительности. С теоретической точки зрения простое разбавление антисыворотки является само по себе очисткой, поскольку при низких концентрациях реагентов в реакцию антиген — антитело существенный вклад будут давать только те молекулы антител, которые обладают высоким сродством. Исключение в этом отношении возможно только в том случае, если популяция антител включает очень небольшое число молекул с высоким сродством и большое число молекул с низким сродством. Наконец, практически пока никому еще не удалось показать повышения чувствительности путем отбора антител; однако сведения о противоположном эффекте также нельзя считать обоснованными, поскольку исходная система в оптимальных условиях никем не исследовалась. В качестве стандартного приема очистку антител рекомендовать ие следует.
8,2.7. Увеличение объема образца
Выше упоминалось о том, что эффективная чувствитель* ность анализа частично зависит от того, какую долю составляет объем образца от общего объема инкубационной смеси (см. разд. 6.1). Из этого следует, что повышения чувствительности можно добиться путем увеличения объема образца относительно объема других компонентов. Во многих методах анализа объем образца составляет всего лишь 10% общего
объема инкубационной смеси (например, 50 мкл в 0,5 мл), однако в связи с тем, что в случае необходимости другие ре-агенты можно добавлять без потери точности в таком маленьком объеме, как 50 мкл, то на первый взгляд кажется, что вполне можно было бы увеличить объем образца до 450 мкл и таким образом повысить чувствительность в 9 раз. В действительности, однако, использование подобного приема ограничено тем обстоятельством, что при добавлении к биологическим жидкостям компонентов в высоких концентрациях могут иметь место неспецифические эффекты, приводящие к искажению результатов анализа (см. разд. 9.3). Величины таких эффектов значительно варьируют в зависимости от способа разделения; они, вероятно, минимальны при использовании вторых антител и твердофазных систем. И тем не менее всегда следует помнить, что увеличение объема образца может приводить к увеличению неспецифического эффекта, в связи с чем необходимо тщательно исследовать вероятность такого эффекта при использовании указанного способа повышения чувствительности. Если содержание образца в инкубационной смеси не превышает 10%, то неспецифический эффект, вызываемый присутствующими в образце примесями, как правило, незначителен.
8.2.8. Температура инкубации
Скорость большинства биологических реакций зависит от температуры; при прочих равных условиях скорость приближения к равновесию в методах связывания удваивается при повышении окружающей температуры на 10°С. Эта закономерность в принципе может быть использована для ускорения анализа. Однако повышение температуры не дает обычно увеличения чувствительности, и в то же время оно может повышать скорость таких нежелательных реакций, как, например, энзиматическое разрушение меченого лиганда. Допустимый верхний предел температуры 45°С.
Основное исключение из этого общего правила составляет группа методов, в которых в качестве связывающих агентов используются связывающие белки крови. Константа сродства этих белков заметно повышается при понижении температур, и соответственно (как и следовало ожидать) повышается чувствительность анализа. Аналогичное явление может наблюдаться при иммунологическом анализе пептидов, в связи с чем в тех случаях, когда требуется исключительно высокая чувствительность, следует проверять возможность использования низких температур (Keane et al., 1976).
