Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 9.1. А. Различные внды специфической неспецнфичности, Одна н та же иопуля* ция аитнтел взаимодействует с двумя родственными соединениями, но с разными константами сродства (т. е. молекулы одного из соединений точно соответствуют связывающему участку, а другого соединения—менее точно). Б. Молекулы одной и той же популяции аитнтел взаимодействуют с общим для двух разных молекул антигенным участком (например, с одной из субъединиц гликопротендиых гормонов). В. Аитн-сыворотка содержит популяции аитнтел, специфичных по отношению к разным лигандам, в Свяви с чем при проведении анализа иеспецифнческий лнгаид может давать
перекрестную реакцию.
ствующего в пробирке лиганда. Такой тип непараллельности встречается только при очень низких концентрациях немеченого лиганда и не всегда обнаруживается при простом взгляде на калибровочную кривую.
Более резко выраженную непараллельность могут вызвать второй и третий тип неспецнфичности, обусловленные гетерогенностью связывающего агента или связывающих участков. Механизм влияния этих видов неспецнфичности на характер кривой лучше всего иллюстрирует экстремальный случай, показанный на рис. 9.2. Ясно, что результаты должны варьировать в зависимости от используемых реагентов, а между тем
50 г
0,008 0,032 0,128 0,5 2 А В
Яонцентраиш стандарта
Рис. 9.2. Пример непараллельности кривых, связанной с гетерогенностью. Анализируемый н меченый лиганды имеют два антигенных участка—А и Б. Антисыворотка содержит соответственно две популяции антител. Лиганд, обладающий только одиим связывающим участком Б» будет давать кривую Б. При аналиве этот лиганд никогда не сможет вызвать полного угнетения связывания, поскольку антитела понуляцин А всегда будут оставаться свободными н связывать меченый лиганд.
в случае радиоиммунологического метода анализа состав популяций антител значительно варьирует при использовании разных антисывороток. Одна антисыворотка будет давать кажущийся параллелизм между двумя перекрестно-реагирую-щими соединениями, тогда как при использовании другой антисыворотки кривые будут непараллельными.
В реальной системе все три типа специфической неспеци-фичности часто могут сосуществовать, и в таких случаях очень трудно установить, что является главным: гетерогенность констант сродства по отношению к одному и тому же связывающему участку или гетерогенность связывающих участков. Однако в случае очень сильно выраженной непа-раллельности, особенно при высоких концентрациях немеченого лиганда, можно предположить наличие гетерогенности связывающих участков. Этот факт имеет большое практическое значение, поскольку идентификация гетерогенности связывающих участков означает, что специфичность может быть повышена путем истощения антисыворотки.
9.2.2. Идентификация специфической иеспецифичности
Для проверки перекрестной реакции готовят и анализируют серию растворов, приготовленных разбавлением исследуемого раствора, и сравнивают полученную при этом кривую с калибровочной кривой для растворов анализируемого вещества известной концентрации. Чаще всего с этой целью сравнивают количество анализируемого материала, угнетающее связывание меченого лиганда на 50%, с тем количеством стандарта, которое дает такое же угнетение, и затем выражают активность материала в процентах от активности стандарта (рис. 9.3). Так, например, если указанные концентрации стандарта и анализируемого материала равны соответственно 1 и 100, то активность будет составлять 1%.
При таком подходе может возникнуть ряд проблем.
Способ выражения концентрации. К сожалению очень часто активность рассчитывают, исходя из относительных концентраций, выраженных в весовых единицах. Если молекулярные веса стандарта и перекрестно-реагирующего вещества одинаковы, то такой расчет правомерен. В противном случае можно получить ошибочные результаты. Так, если молекулярный вес перекрестно-реагирующего вещества в 10 раз больше молекулярного веса стандарта, а его активность, выраженная через весовую концентрацию, составляет 10%, то из этого можно сделать вывод, что их молекулы обладают одинаковой активностью. Чтобы избежать такой ловушки, всегда следует рассчитывать результаты, исходя из молярных концентраций.
Концентрация стегнвар/па
Рас. 9.3. Расчет процента перекрестной реакции, основанный аа определении количества вещества, вызывающего 50%-ное угнетение связывания. Левая кривая получен» для стандарта, правая—для перекрестнореагнрующего соединения. Заметим, что такой способ расчета применим .только в случае параллельных кривых.
Вариации, связанные с условиями анализа. Кажущаяся активность перекрестно-реагирующего вещества может меняться в зависимости от условий, в которых проводится анализ. При понижении чувствительности анализа в результате повышения концентрации связывающего агента может проявиться действие популяции антител, обладающих неспецифи-ческими связывающими участками и не дающих при более низких концентрациях никакого эффекта. Болёе важное значение имеет тот факт, что специфичность может сильно варьировать в зависимости от природы используемого меченого лиганда: примеры подобного рода рассмотрены в разд. 2.2 и на рис. 2.1. Аналогичные, хотя и не столь сильно выраженные, эффекты могут иметь место при замене высокоочищенного меченого лиганда на менее очищенный.
