Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
светятся зеленым; ядро при этом ярче цитоплазмы. При увеличении pH от 3
до 5 цвет люминесценции цитоплазмы клеток изменяется от зеленого через
розовый к красному и кирпичнокрасному, при pH 5 ядро становится желто-
оранжевым, при pH выше 6 все клетки кирпично-красные. Для изучения НК
лучше использовать рабочие растворы этого красителя с pH 4-5. Обычно
пользуются цитратным или цитратно-фосфатным буфером с pH 4,2-4,4; время
обработки - 10 мин; время промывки - 10-12 мин. После промывки препарат
подсушивают и помещают в специально приготовленную дисперсную среду,
которая не флюоресцирует. Ее готовят из 10 г гуммиарабика, 10 мл воды, 5
мл глицерина и 1 г хлоралгидрата. Препарат накрывают покровным стеклом,
предварительно вымытым в хромовой смеси и идеально, протертым, и
исследуют. Для временных препаратов можно использовать и воду, но все же
лучше готовить препараты в дисперсной среде [192]. Для постоянных
препаратов готовят среду следующего состава: равные количества глицерина
и лимонной кислоты нагревают до полного растворения кристаллов и заливают
объект на предметном стекле, сразу накрывая его покровным стеклом.
Для окраски микологических объектов в качестве флюорохромов используют
различные красители и пигменты, как правило, в очень низких разведениях
(1 : 20 000-1 : 100 000). Подбирая различные флюорохромы для общей
окраски клетки или дифференциации ее структур, устанавливают, какое
свечение характерно для исследуемого организма в разных условиях.
94
Иногда применяют несколько флюорохромов. Так, смесь (1 : 1) раствора
фуксина (1 : 1000) и корифосфина (1 : 1000) окрашивает ядра в желтый
цвет, протоплазму - в красный, ядрышки - в темно-оранжевый, хроматиновые
элементы - в зеленый, а кариоплазма остается неокрашенной. Наиболее
применяемые флюорохромы приведены в табл. 1, 2.
11.2.2.3. ПРЯМОЕ ФЛЮОРОХРОМИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР
Флюорохромирование клеточных оболочек и перегородок. Живые и
фиксированные препараты обрабатывают водным раствором примулина О (1 : 10
000). Перегородки светятся зеленым цветом (рис. 50). При-мулин относится
к кислым флюорохромам, светящимся компонентом которых является
отрицательно заряженный ион [54].
Рис. 50. Свечение перегородок макроконидий, конидиеносцев, гиф Fusarium
javanicum при флюорохромировании препарата примулином.
Флюорохромирование ядер. Для витального флюорохромирования применяют
акридиновый оранжевый в разведении 1 : 100 000. ДНК при этом
люминесцирует зеленым светом, РНК красным, протоплазма имеет слабое
темно-зеленое свечение, ядро - ярко-зеленое, ядрышки - светло-зеленое,
метахроматин - огненно-красное [264, 288]. Флюорохромирование ядер в
клетках живых и фиксированных препаратов акридин-ипритом проводят по
следующей схеме: фиксация в смеси равных объемов метилового спирта и
ацетона - 10 мин при комнатной температуре; проводка через ряд спиртов
(96-, 60-, 30%-ный); гидролиз в 2 н. растворе NaOH - 30 мин; окрашивание
акридин-ипритом в фосфатно-цитратном буфере (pH 4,5) - 30 мин при
температуре 4е С. Концентрация флюорохрома 0,005 мкг/мл. Окрашенные
препараты помещают в смесь глицерина и того же буфера (1:1) и сохраняют
несколько месяцев в холодильнике [469].
95
Определение количественного содержания ДНК по люминесцентному варианту
метода Фельгена с аурамином 00 проводят по схеме: фиксация в жидкости
Карнуа - 5 мин; проводка через нисходящую серию спиртов до воды;
промывание в 1 н. соляной кислоте; гидролиз в 6 н. соляной кислоте - 8
мин; промывание в 1 н. соляной кислоте; окрашивание в растворе аурамина -
60 мин; промывка в трех порциях сернистых вод по 3 мин в каждой; промывка
в проточной воде - до 20 мин; обезвоживание проводкой через восходящую
серию спиртов до абсолютного; помещение препарата в нелюминесцирующее
масло. Ядра люминесцируют зеленым цветом. Количественное определение ДНК
проводят на микроцитофлюориметре (см. рис. 47, б).
Флюорохромирование митохондрий. Препарат обрабатывают бер-берин-сульфатом
(желтое свечение), аурофосфином, корифосфином, тиофлавином (желто-
оранжевое свечение) в разведении 1 : 100 000 [289, 290].
Флюорохромирование волютина (метахроматина). Препарат фиксируют метиловым
спиртом 8 с; промывают водой и высушивают; окрашивают рабочим раствором
корифосфина (2 мл основного раствора корифосфина в разведении 1 : 1000 и
5 мл уксусной кислоты доводят до объема 50 мл дистиллированной водой);
промывают водой и высушивают на воздухе. Гранулы волютина имеют огненно-
красное свечение.
Флюорохромирование жировых включений. Препарат обрабатывают фосфином 3R
(ярко-зеленое свечение), нейтральным красным (желто-зеленое свечение),
нильским голубым (оранжевое свечение) в разведении 1 : 100 000 [2].
Люминесцентный спектральный анализ клетки. Методы спектрального анализа
позволяют изучать физико-химические процессы, протекающие в живой клетке
и ее органоидах, определять соотношения ДНК, РНК, белков и липидов
благодаря тому, что многие молекулы, входящие в состав клетки, обладают
