Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Для исследования целых клеток гиф и конидий готовят их суспензию и
очищают ее от посторонних примесей, так как суспензия должйа быть
максимально однородной. При исследовании вегетативных или спороносных
органов грибов, выращенных в любых условиях, с поверхности колонии или
плодового тела микологическим крючком осторожно снимают верхний слой
клеток. Во время соскреба крючок должен легко скользить по поверхности
спороношения, чуть прикасаясь к нему. Для получения суспензий из колоний,
выросших на твердой среде, делают их смыв дистиллированной водой или
физиологическим раствором, а полученную суспензию центрифугируют
4*
09
10-15 мин при п = 500-800 об/мин и разделяют полученные фракции, которые
исследуют в зависимости от цели опыта [402, 453, 460].
Иногда суспензию предварительно подвергают капельному диализу. В чашку
Петри наливают дистиллированную воду и на ее поверхности помещают
коллодиевую пленку. После испарения эфира на пленку помещают капли
исследуемой суспензии и оставляют для диализа на 4-6 ч. Соли из суспензии
диффундируют в дистиллированную воду, а более крупные частицы разрушенных
тканей оседают на пленке. Потом из этой капли пастеровской пипеткой
осторожно отбирают самый верхний слой и переносят на сетку с пленкой.
Для сохранения объекта перед центрифугированием его фиксируют формалином
или осмием. Обычно применяют нейтральный формалин (40%-ный водный раствор
формальдегида), который добавляют к получаемой суспензии из расчета 0,5-
1,0 мл на 100 мл суспензии. Время фиксации 1-2 сут, так как после
кратковременной фиксации объект разрушается при дальнейшей обработке и
промывках. Ткани, фиксированные формалином, заметно разбухают при заливке
в метакрилаты, поэтому рекомендуется дополнительная фиксация
четырехокисыо осмия. Для этого ткани после фиксации в формалине и
промывки выдерживают 1-2 ч в 1%-ном незабуференном растворе четырехокиси
осмия.
Из осмиевых фиксаторов наиболее распространен универсальный фиксатор
Паладе, который готовят следующим образом. В бюкс, стоящий на льду,
сливают приготовленные заранее растворы в определенном порядке: 0,28 М
раствор ацетата натрия (0,5 мл), 0,28 М раствор натрийверонала (мединала,
0,5 мл), 0,1%-ный раствор соляной кислоты (1,0 мл), 2%-ный раствор
четырехокиси осмия (2,5 мл). pH раствора не должно превышать 8,0 (лучше
7,6); значения pH регулируют в зависимости от заданного уровня, добавляя
несколько капель натрийверонала или соляной кислоты. Все растворы готовят
на биди-стиллированной воде и хранят в темной посуде в холодильнике.
Исходный раствор четырехокиси осмия готовят так: в химически чистую
склянку наливает нужное количество бидистиллированной воды и вносят в нее
предварительно приготовленный фиксанал Os04.
Рис. 51. Строение гиф Penicillium sp., выращенного на неопептоне
глубинным способом:
а - продольный срез через гифу, фиксированную Os04 (X 15000; деление на
снимке соответствует 0,66 мкм); б - продольный срез через гифу,
фиксированную перманганатом (X 15000; деление на снимке соответствует
0,45 мкм); в - поперечный срез через гифу, фиксированную 0s04 (X 15000;
деление на снимке соответствует 0,45 мкм); г - поперечный срез через
гифу, фиксированную перманганатом (X 15000; деление на снимке
соответствует 0,5 мкм). М -- митохондрии; N - ядра; L - жировые тельца; G
- гранулы полисахаридов.
101
Таблица 3. Состав цитрат-фосфатных буферных растворов Мак-Ильвейна
pH Компоненты буфера, мл
Лимонная кислота 0,1 М (21,008 г/л моногидрата) Фосфат натрия
двузаме-щенный 0,2 М (35,65 г/л Na2HP04X Х2Н,0)
7,0 3,53 16,47
7,2 2,61 17,39
7,4 1,83 18,17
7,6 1,27 18,73
7,8 0,85 19,15
8,0 0,55 19,45
Полученный раствор должен иметь желтоватый оттенок и быть совершенно
прозрачным. Раствор стабилизируют хромовым ангидридом из расчета один
кристалл величиной с булавочную головку на 150 мл забу-ференного
раствора. Стандартные буферные растворы получают при сливании растворов
лимонной кислоты определенной концентрации и двузамещенного фосфата
натрия (табл. 3).
Фосфат натрия перед растворением выдерживают в течение 2 сут при 37° С,
при этом содержание воды в нем уменьшается до 2 молекул, поскольку в
продажном реактиве их количество обычно больше.
Фиксацию в парах осмия применяют, если объект насыщен влагой и объем его
не достигает 1 мм3. В небольшой бюкс наливают 2-4% -ный незабуференный
раствор четырехокиси осмия. На предметное стекло наносят каплю взвеси с
объектом так, чтобы жидкость равномерно распределялась по стеклу, не
стекая с него; переворачивают стекло объектом вниз и плотно накрывают им
бюкс с раствором. Время фиксации зависит от объекта - срезы гиф и
различных субстратов с ними фиксируют 1-3 ч, конидии - 20-30 мин.
Температура фиксации - комнатная.
Фиксатор Клофильда используют для фиксации тканей, пораженных грибами,
поскольку фиксатор Паладе гипотоничен. Для этого готовят буфер из
расчета: 14,7 г натрийверонала (мединала), 9,7 г ацетата натрия, до 500
