Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
акриламидные гели. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет не только разделять, но и очищать и концентрировать макромолекулы (например, при добавлении к исследуемому раствору сухих гранул геля с диаметром пор меньше, чем диаметр молекул).
Для выделения различных мембранных структур используется и аффинная хроматография. Принцип этого метода заключается в способности выделяемого вещества’ специфически связываться с лигандом, “пришитым” к нерастворимому носителю, при пропускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (агарозные гели), активируемые путем связывания различных лигандов: кофакторов, ингибиторов, субстратов мембранных белков-ферментов, лектинов в случае выделения гликопротеинов; гормонов, бромциана, конканавалина А — соответственно при получении мембран, антител или целых клеток. Элюирование исследуемого вещества осуществляют в условиях диссоциации комплекса лиганд — вещество и сохранения нативной структуры выделяемого соединения.
Заряженные компоненты биомембран разделяют методом электрофореза по скорости их движения в электрическом поле, которая зависит от величины заряда, молекулярной массы и формы молекул. Максимальное разделение макромолекул (в частности, мембранных белков) обеспечивается при использовании метода диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Его название “диск” происходит от дискретного напряжения электрического поля, что обусловлено прерывистым градиентом pH в системе. Верхняя часть полимеризующегося геля в стеклянной вертикальной трубке, на которую наносится исследуемый образец, имеет меньшую концентрацию, а нижняя часть (разделяющий гель) — большую. За счет большого размера пор верхних слоев геля и большого градиента электрического поля происходит быстрое движение и накопление вещества на верхней границе разделяющего геля, в котором в зависимости от подвижности разделяемых белков образуются различные зоны, которые идентифицируют после удаления геля из трубки. Для определения молекулярной массы мембранных белков используют SDS— ПААГ-электрофорез с применением додецилсульфата натрия (ДСН, SDS), связывающегося с белком и вызывающего его диссоциацию. Подвижность белка в комплексе с ДСИ будет определяться только молекулярной массой биополимера, а заряд — до-
децилсульфатом (при постоянстве количества связываемого любого типа белка додецилсульфатом: 1,4—1,5 г ДСН на 1 г белка). Количественные измерения проводят оптическим методом с использованием денситометра.
Разновидность электрофореза — изоэлектрическое фокусирование. Метод основан на электрофоретическом разделении смеси белков в градиенте pH с достижением изоэлектрической точки (ИЭТ) каждого белка и его “фокусированием” в отдельной зоне и применяется для быстрого и эффективного фракционирования больших количеств (несколько граммов) образца на начальных стадиях его очистки.
5.3. ОЦЕНКА ЧИСТОТЫ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ
Наиболее часто для оценки чистоты выделенных мембранных фракций используют методы исследования удельной активности ферментов, называемых маркерами. Маркерные ферменты должны быть локализованы в определенном типе мембранных структур и катализировать реакции, соответствующие специфическим функциям этих мембран. Кроме того, фермент можно использовать как маркер, если он прочно связан с мембраной и не подвергается активации или ингибированию при разделении мембранных фракций (табл. 17). Активность маркерных фермен-
Таблица 17
Биохимические маркеры, используемые для контроля чистоты мембранных фракций
Мембранная фракция Маркерный фермент
Плазматические мембраны б'-Нуклеотидаза (КФ 3.1.3.б)
Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1)
Аденилатциклаза (КФ 4.6.1.1)
Na+, К+-АТФаза(КФ 3.6.1.3)
Ядра NAD-лирофосфорилаза (КФ 2.7.7.1)
Эндоплазматическая сеть Глюкозо-6-фосфатаза (КФ 3.1.3.10)
Микросомы NADPH-дегидрогеназа (КФ 1.2.1.16)
Пероксисомы Каталаза (КФ 1.11.1.6)
Лизосомы Кислая РНКаза (КФ 3.1.4.8)
Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2)
Сарконлазматический ретикулум Са2+АТФаза (КФ 3.6.3.3)
Митохондрии: Моноаминоокеидаза (КФ 1.4.3.4)
наружная мембрана Цитохромоксидаза (КФ 1.9.3.1)
внутренняя мембран Цитохром-с-редуктаза (КФ 1.6.9.3)
Цитозоль Лактат дегидрогеназа (КФ 1.1.1.27)
тов контролируют на каждом этапе выделения и разделения мембран в исходном гомогенате и в каждой фракции с целью определения стадии осаждения и выхода исследуемых мембранных структур, а также потерь мембранных фракций. Гомогенность выделенного препарата мембран анализируют на основании увеличения активности маркерного фермента (-ов) в нем по сравнению с исходным гомогенатом клеток. Часто используют не один, а два-три мембранных маркера. Однако необходимо помнить, что и мембраны одного типа способны проявлять гетерогенность, связанную с асимметрией белкового, липидного и углеводного состава мембран, в результате чего фермент может находиться в латентной форме из-за нарушения ориентации мембраны и недоступности активного центра для субстрата, например, в обращенных мембранных везикулах. Наиболее легко из внутриклеточных органелл идентифицируют митохондрии и ядра, затем — лизосомы и пероксисомы, наиболее трудно — плазматические мембраны и мембраны эндоплазматической сети. Сложность разделения последних обусловлена близостью величин диапазона плотностей этих структур, поэтому разделение по скорости седиментации осуществляется в том случае, если плазматические мембраны представлены крупными фрагментами.
