Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Для количественной оценки поляризованной люминесценции используют степень поляризации (Р) люминесценции:
Р - (1ц - IJ/(1п + I,), где 1П и 1х — соответственно параллельная и перпендикулярная электрическому вектору возбуждающего света составляющие поляризованной люминесценции.
Степень анизотропии (г ) излучения определяется по формуле:
r = (Jn “ У/О* + 2Ij).
Использование этой характеристики для описания процессов поляризованной люминесценции более корректно, так как учитывает третью составляющую, перпендикулярную электрическому вектору возбуждающего света (т.е. в знаменателе уравнения для определения г находится величина, пропорциональная суммарному значению интенсивности).
Связь между величинами Риг отражает следующее уравнение:
г = 2Р/(3 - Р).
Анизотропия оптической среды проявляется как при испускании, так и при поглощении света. Для характеристики анизотропии поглощения света используют степень дихроизма d: d = (Dn - Dx)/(Dn + Dx),
где Dn и Dx — оптические плотности, измеренные при облучении исследуемого образца линейно-поляризованным светом с колебаниями электрического вектора, параллельными и перпендикулярными главной оптической оси системы.
Перреном и Яблонским установлена связь между степенью поляризации (Р) флуоресценции и вязкостью среды (ц):
1/Р - 1/3 = (1/Р0 - 1/3) • (tRT/Vti + 1),
где Р0 — предельное значение поляризации при T/rj -> 0; R — универсальная газовая постоянная; Т — абсолютная температура; V — объем моля флуоресцирующих молекул; х — время жизни возбужденного состояния. Этой формулой пользуются для расчета значений т.
Варьируя угол направления поляризации флуоресценции, устанавливают направление и степень ориентации молекул в анализируемом образце. Исследование поляризации флуоресценции позволяет изучать миграцию энергии в биосистемах, определять размеры биомакромолекул и время жизни их возбужденного состояния. Поляризацию флуоресценции определяют для того, чтобы судить о микровязкости мембраны.
Так, микровязкость мембраны изучают путем измерения Р для флуоресцентного зонда, введенного в исследуемую систему. Метод флуоресцентных зондов подробно рассмотрен в разделе 6.4.
В целом флуоресцентный метод анализа — один из безынерционных, высокочувствительных методов исследования, применяемых для качественного и количественного анализа смесей веществ, изучения механизма фотофизических и фотохимических процессов в биосистемах и конформационных свойств биомакромолекул.
Инфракрасная (ИК) спектроскопия занимается анализом молекулярных спектров, так как в ИК-области спектра (10 ООО—400 см-1) расположено большинство колебательных и вращательных спектров молекул. В ИК-диапазоне поглощается свет тех частот, которые равны частотам колебаний атомов в молекуле. ИК-спектр поглощения, возникающий в результате поглощения ИК-излучения при прохождении его через вещество, состоит из большого числа полос, причем часть полос поглощения обусловлена колебаниями отдельных атомных группировок, более или менее сохраняющих свои свойства в разных молекулах. Характеристики ИК-спектра (число полос поглощения, их положение, определяемое частотой v или длиной волны X, ширина и форма, интенсивность поглощения в максимумах) определяются структурой и химическим составом поглощающего вещества и зависят от его структурного состояния, а также температуры, давления и других факторов. Метод ИК-спектроскопии позволяет определять структуру молекул, их химический состав, моменты инерции, величины сил, действующих между атомами в молекуле, проводить качественный и количественный анализ смесей различных веществ.
Сущность одного из видов метода ИК-спектроскопии — ИК-дихроизма — заключается в измерении разности поглощения света, поляризованного вдоль оси ориентации и перпендикулярно этой оси ориентации молекулы. С помощью измерения ИК-дих-роизма можно установить, как направлены важнейшие группы белка (> С = О и -NH) по отношению к оси его макромолекулы. Необходимыми для определения частотами пептидной связи белков являются следующие: 3330 см"х для валентного колебания -NH-группы (колебание ядер вдоль линии связи между атомами в молекуле), 1660 см-1 для валентного колебания >СО-группы и 1550 см-1 для деформационного колебания (колебания, обусловленные периодическими изменениями угла между связями отдельных атомов в молекуле ) NH-группы. Анализ смещения этих полос поглощения, изменения их ширины, формы, величины по-
глощения позволяет судить о состоянии вторичной структуры белков и полипептидов.
Дисперсия оптического вращения (оптической активности) — зависимость угла вращения (поворота) плоскости поляризации света (ф) или удельной оптической активности (удельного вращения [а]) от длины волны X оптического излучения, проходящего через среду:
ф = [а] /с,
где I — толщина слоя активного вещества или его раствора; с — концентрация этого вещества.
Поворот плоскости поляризации в данной среде происходит либо по часовой стрелке (ф>0), либо против часовой стрелки (ф<0), если смотреть навстречу ходу лучей. В связи с этим вещества, проявляющие естественную оптическую активность, не вызываемую наличием внешних полей, разделяют на правовращающие (положительно вращающие — d, ф>0) и левовращающие (отрицательно вращающие — /, ф<0). Ж. Био (1815) установил, что в случае чистых жидкостей, растворов и паров многих органических веществ угол вращения плоскости поляризации ф тем меньше, чем больше X (ф ~Хг2). Такая дисперсия оптического вращения (ДОВ) характерна для нормальной оптической плотности — вдали от длин волн Х0, на которых в оптически активном веществе происходит резонансное поглощение. Э. Коттон, изучавший оптическую активность для излучений с X, близкими к А,0 (212 нм), обнаружил аномальную оптическую активность — увеличение ф с ростом X.
