Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Гидрофильные спиновые зонды, представляющие собой модификацию зонда TEMPO и изменяющие свой заряд в зависимости от величины pH, способны связываться с различными участками полярных групп мембраны за счет электростатических взаимодействий. Их используют для исследования поверхностного потенциала и плотности заряда мембранной поверхности.
Более предпочтительным для изучения биомембран является одновременное применение нескольких зондов, по-разному взаимодействующих с компонентами мембран, что позволяет исследовать цитоплазматическую и наружную поверхности мембран клеток и клеточных органелл.
Таким образом, метод ЭПР применяют для изучения фазовых переходов в липидном бислое, микровязкости мембран, подвижности углеводородных цепей, латеральной диффузии и “флип-флоп”-переходов. Недостаток этого метода заключается в том, что введение зонда изменяет структуру бислоя и свойства мембраны. Метод ЭПР более чувствителен по сравнению с методом ЯМР, так как магнитный момент электрона в 1000 раз выше, чем ядра.
С помощью метода электронной микроскопии (разрешающая способность электронного микроскопа находится в диапазоне 2—
4 нм и превышает таковую для оптического микроскопа более чем в 500 раз) исследуют морфологию внутренних поверхностей двух монослоев, распределение фаз в мембране, трехмерную молекулярную структуру мембранных белков, форму и размеры солюбилизированных мембранных белков. Однако необходимость проведения обезвоживания, фиксации и контрастирования объекта солями тяжелых металлов приводит к существенной модификации структурного состояния компонентов мембран.
Разновидность метода электронной микроскопии — “замораживание—скалывание”. Его применяют для изучения характера связывания белков с мембранами. Для этого образец, не требующий химической фиксации, замораживают в жидком азоте, а затем раскалывают в плоскости наименьшего сопротивления холодным ножом в вакууме. Плоскость наименьшего сопротивления проходит между двумя слоями липидной фазы мембраны. Далее поверхность образца покрывается платиной и углеродом, его растворяют и отпечаток (реплику) рассматривают в элект-
ронный микроскоп. Если лед возгоняют с поверхности образца, то модификацию метода называют “замораживание—гтравление”.
Оптические методы позволяют получить информацию о механизме фотосинтеза, электронном транспорте, транспорте кислорода в тканях, транспорте ионов, взаимодействии веществ различной природы с мембранами, белок-липидных взаимодействиях и других процессах. Они основаны на присутствии в изучаемой системе эндогенных или экзогенных (вносимых в систему экспериментатором) хромофорных групп. К эндогенным хромофорам относятся порфирины, флавины; каротиноиды, пиридин-нуклеотиды, цитохромы, гемоглобин, миоглобин, которые поглощают свет в видимой области спектра. Акридины, нафталин-сульфонаты, цианины являются экзогенными хромофорами. К оптическим методам относят абсорбционную спектрофотомет-рию, люминесценцию, метод флуоресцентных зондов, а также круговой дихроизм, дисперсию оптического вращения. Последние наряду с ИК-спектроскопией и спектроскопией комбинационного рассеяния используются для определения содержания различных элементов вторичной структуры молекулы белка, позволяют изучать ее конформационные переходы.
Люминесценция наблюдается в результате поглощения веществом энергии возбуждения, перехода его частиц из основного в возбужденное электронное состояние и обратно. Она представляет собой свечение атомов, ионов, молекул и их комплексов, возникающее в результате электронного перехода из возбужденного состояния в основное.
Все известные виды люминесценции подразделяют на два больших класса: флуоресценцию и фосфоресценцию. Под флуоресценцией понимают свечение, мгновенно (10~9 с) затухающее после прекращения возбуждения. Квант флуоресценции испускается при переходе из синглетного возбужденного состояния Sj (с его нижнего колебательного подуровня) в синг-летное основное состояние S0: St* —» S0 + hv^. Фосфоресценция — свечение, продолжающееся в течение длительного промежутка времени (>10_сс) после прекращения возбуждения. Квант фосфоресценции высвечивается при переходе (с обращением спина) электрона из триплетного возбужденного состояния Т, в основное состояние: Т, —» SA + In' .
1 10 фос
Есть и другие виды классификации люминесценции: по типу возбуждения свечения и кинетике процесса люминесценции. Так,
в случае возбуждения вещества световыми квантами возникающее при этом свечение называется фотолюминесценцией.
В зависимости от кинетических характеристик свечения выделяют резонансную, спонтанную, вынужденную и рекомбинационную люминесценцию.
Резонансная флуоресценция — основа процесса атомной люминесценции — представляет собой излучение фотонов той же энергии, что и у поглощенных фотонов возбуждающего света; наблюдается в газах и кристаллах.
При спонтанной люминесценции после возбуждения молекула сначала переходит на высокий возбужденный электронный уровень S2, а затем путем безызлучательного перехода — на более низкий возбужденный уровень Sr Квант люминесценции высвечивается при переходе Sj —> S0, поэтому его величина оказывается меньше, чем у поглощенного кванта. Спонтанная люминесценция наблюдается у паров, растворов сложных молекул, молекулярных кристаллов.
