Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
чение для понимания структурно-функциональной организации нативных биологических мембран.
Необходимо отметить, что для решения определенной научной задачи применяют не один, а целый ряд методов, что позволяет скомпенсировать недостатки и ограничения каждого из них за счет достоинств других методов. Так, например, для исследования белок-липидных взаимодействий используют методы ЭПР, ЯМР, измерения флуоресценции, комбинационного рассеяния, ИК-спектрофотометрии и др.
5.2. ВЫДЕЛЕНИЕ И РАЗДЕЛЕНИЕ МЕМБРАН
Выделению мембран предшествует этап разрушения клеток и тканей. Для этого подбирают методику, позволяющую не только эффективно разрушать клетки, но и сохранять нативную структуру мембран, подлежащих выделению. При выделении большинства мембран животных клеток используют гомогенизацию в гомогенизаторах Даунса и Поттера со стеклянными стенками и тефлоновым пестиком. Для разрушения клеток применяют также вращающиеся ножевые гомогенизаторы. Предварительно свежевыделенную ткань измельчают и промывают водой. В гомогенизаторе клетки разрушаются за счет сдвиговых усилий, возникающих при продавливании суспензии через узкий зазор между тефлоновым пестиком и стеклянной стенкой. При гомогенизации следует тщательно подбирать значение pH, ионную силу и состав буферного раствора. Часто в качестве суспендирующей среды используют раствор сахарозы в концентрации 0,25 моль/л с добавлением хлорида магния, комплексообразователей (например, ЭДТА), восстановителей (дитиотреитол, (З-меркаптоэтанол).
С целью облегчения последующего разрушения растительных, грибных и бактериальных клеток их сначала обрабатывают ферментами, расщепляющими компоненты клеточной стенки (лизо-цим, целлюлаза). Более жесткая обработка клеток предусматривает их растирание с помощью абразивных материалов (стеклянных шариков, песка, оксида алюминия), разрушение ультразвуком и путем экструзии (продавливание суспензии клеток через отверстия под давлением). Полученный гомогёнат клеток процеживают и используют дальше для получения мембран.
Чаще всего для разделения мембран применяют метод центрифугирования. Мембранные частицы разделяют по скорости их седиментации (зональное центрифугирование) или по плавучей
плотности (изопикническое центрифугирование). Коэффициент седиментации (S) определяется по формуле:
S = v/w2r = m(l - Vp)/f, где v — скорость движения частицы; w — угловая скорость вращения ротора; г — расстояние до центра вращения; ш — масса частицы; f — коэффициент трения; р — плотность растворителя; V — парциальный удельный объем частицы (равный увеличению объема, вызываемого прибавлением единицы массы растворяемого вещества к раствору).
Величина коэффициента седиментации зависит от нескольких факторов: концентрации раствора, скорости движения частиц, заряда, формы и массы частиц. Введено понятие стандартного значения константы седиментации, определяемое в системе, имеющей вязкость и плотность воды при +20 °С (S°0).
Для выделения различных мембранных структур из гомоге-ната, имеющих разные величины коэффициента седиментации, применяют зональное центрифугирование в градиенте плотности определенных веществ. Исследуемый раствор наносят на предварительно приготовленный в центрифужной пробирке градиент плотности и центрифугируют. Градиент создается путем последовательного наслоения растворов градиентной среды уменьшающейся концентрации (плотности) в центрифужной пробирке. Субклеточные структуры разделяются на отдельные зоны в соответствии с их относительной плотностью. Для создания градиента плотности необходимо подбирать вещества в чистом состоянии, не взаимодействующие с компонентами суспензии и реагентами исследуемого раствора. Чаще всего для этого используют сахарозу, однако ее растворы с высокой концентарцией имеют большую вязкость, вследствие чего происходит дегидратация органелл или их лизис. Кроме того, серьезным недостатком этого метода является проницаемость многих органелл для сахарозы, что вызывает их осмотическое разрушение и изменение эффективной плотности. Поэтому в настоящее время для создания градиента плотности предпочитают применять другие среды: фиколл, перколл и др. (табл. 16).
Основные компоненты клетки осаждают в такой последовательности: целые клетки и их фрагменты, ядра, митохондрии, лизосомы, микротельца, микросомы (фрагменты эндоплазмати-ческой сети и плазматических мембран), отдельные типы мембранных структур.
Таблица 16
Характеристика некоторых градиентных сред для выделения мембранных компонентов методом центрифугирования
Среда Структура Кон Плот Вяз Осмоляль- Преимущества или
цент ность, кость, ность, недостатки
рация, г/мл сП мОсм/кг
% н2о
Сахароза Дисахарид 20 1,06 30 700 Гипертонические раство
<W>u ры способны вызывать ли
