Руководство по экспериментальной хирургии - Шалимов С.А.
Скачать (прямая ссылка):
Биуретовая реакция лежит в основе широко применяемого в ряде лабораторий метода Лоури, повышающего чувствительность биуретовой реакции примерно в 100 раз.
Приводим его описание так, как оно изложено в 12-м томе 3-го издания Большой медицинской энциклопедии.
Готовят следующие реактивы: А — 2% раствор Na2C03 в 0,1 н. растворе NaOH; Б — 0,5% раствор CuS04-5H20 в 1% растворе лимоннокислого или виннокислого натрия; В — смесь 1 мл реактива Б с 50 мл реактива А; реактив Фолина — Чокалтеу: 20 г вольфрамовокислого натрия, 5 г молибденовокислого натрия растворяют в 140 мл воды, добавляют 10 мл 80% фосфорной кислоты и 20 мл концентрированной гидрохлористой кислоты. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 10 ч, добавляют 30 г сернокислого лития, 10 мл воды и несколько капель брома. Общий объем смеси доводят водой до 200 мл и фильтруют. Хранят в темной посуде; Г — готовят непосредственно перед употреблением разбавлением реактива Фолина — Чокалтеу водой до конечно/! концентрации кислоты 1 н.
Для исследования 0,4 мл белкового раствора, содержащего 5—40 мкг белка, смешивают с 2 мл свежеприготовленного реактива В, и смесь оставляют стоять при комнатной температуре. Через 10 мин к ней быстро добавляют 0,2 мл реактива Г и тщательно перемешивают. Спустя 30—40 мин измеряют величину экстинкции при 750 нм. Интенсивность окрашивания, если содержание белка в пробе превышает 40 мкг, не строго пропорциональна его истинной концентрации. В таких случаях пробу следует развести в два раза, а калибровочную кривую строить, исходя из пределов содержания белка от 5 до 40 мкг. Кроме того, разные белки также дают разную интенсивность и оттенки окрашивания пробы, поэтому желательно калибровочную кривую строить с тем; белком, содержание которого будет определяться в дальнейшем.
Соотношение белковых фракций в сыворотке крови определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле (7 % раствор акриламида в трисацетатном буферном растворе pH 8.5). При этом сыворотка крови собак разделяется на 12—18 и более фракций, объединяемых затем в так называемые стабильные группы, соответствующие основным классам белков и литтопро-теидов. Поскольку сама электрофореграмма дает лишь косвенное представление о составе белков сыворотки крови, ее после окраски амидо черным подвергают денситометрии и рассчиты-
110
Рис. 46. Расчет денситограммы по Г. Мауреру. Схема. Объяснения в тексте.
V-
вают соотношение белковых фракций в процентах по отношению к общему количеству белка [Бойко Ю. Я., 1972; Маурер Г., 1971].
Методика расчета следующая (рис. 46).
Получив денситограмму, проводят базисную линию MN через точки начала и окончания записи экспоненциальной и начала интегрирующей кривых. Из точки А (конец записи интегрирующей кривой) опускают перпендикуляр AAi на базисную линию. Из точки А проводят линию АВ длиной 100 мм до ее пересечения с базисной линией MN. Измеряют величину ошибки отставания, равную расстоянию между точками начала записи интегрирующей и экспоненциальной кривых (С). Проводят разметку экспоненциальной кривой, отмечая началб каждого ее изгиба, соответствующего изменению плотности электрофо-реграммы, зависящей от содержания белка данной фракции. Из каждой отметки на экспоненциальной кривой параллельно линии AAi опускают перпендикуляр до пересечения с интегрирующей кривой с учетом ошибки отставания. Из точек, полученных таким образом на интегрирующей кривой, восстанавливают паралелльно линии MN перпендикуляр до пересечения с линией АВ. Измеряют расстояние между полученными на линии АВ отметками в миллиметрах. Сумма этих расстояний составляет 100 мм и представляет собой соотношение белковых фракций в данной пробе сыворотки, выраженное в процентах.
Наряду с определением содержания 'общего белка в сыворотке крови по Лоури или биуретовым методом применяют более простой микробиуретовый метод, дающий вполне сопоставимые с ними результаты. Он заключается в следующем.
\
К 0,2 мл исследуемого раствора добавляют 0,2 мл 6% раствора NaOH, 3,6 мл 3% раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта (86.5 г трехзамещенного цитрата натрия+ 50 г гидрокарбоната натрия+ 8,65 г сульфата меди + вода до 500 мл); исследуют на спектрофотометре при длине волны 330 нм. Контрольным образцом является 4 мл 3% раствора NaOH, к которому добавлено 0,2 мл реактива Бенедикта. Калибровочный график строят по результатам исследования различных концентраций сывороточного альбумина при общем его содержании от 0,1 до 6 мг в 0,2 мл воды.
111
Приводим содержание белка и соотношение белковых фракций в сыворотке крови беспородных собак: общий белок 59— 87 г/л; альбумин 0,22—0,46 мкмоль/л; глобулины 0,426— 0,451 мкмоль/л; сн-глобулин 0,055—0,20 мкмоль/л; а2-глобулин 0,20—0,53 мкмоль/л; церулоплазмин 0,03—0,14 мкмоль/л; транс-феррин 0,025—0,150 ммоль/л; медленный липопротеид 0,05— 0,17 мг/л.
Содержание липидов и жирных кислот в сыворотке крови беспородных собак: общие липиды 3,4—5,5 г/л; липидный фосфор 0,06—0,25 г/л; фосфолипиды 1,5—3,75 г/л; общие липопро-теиды 4,4—6,8 г/л; а-фракция 3,2—5,2 г/л; рефракция 1,0— 3,2 г/л; общий холестерин 1,05—2,35 г/л; эфиросвязанный холестерин 0,64—1,68 г/л; свободный холестерин 0,31—0,92 г/л; кислоты — меристиновая — 8,6—13,4 %, пальмитиновая 18,7— 27,8%, стеариновая 32,1—39,1 %, арахидоновая 5,1—8,5%.
