Руководство по экспериментальной хирургии - Шалимов С.А.
Скачать (прямая ссылка):
Образованный градиент подвергают центрифугированию 30 мин при 800— 1000 об/мин, отсасывают образовавшийся на границе раздела жидкостей белый слой клеток, содержащий лимфоциты и моноциты, переносят их в пробирку с 5 мл раствора Хенкса, дважды отмывают этим раствором путем центрифугирования взвеси по 10 мин при 1000 об/мин и последующего ресуспендирования, подсчитывают число клеток, доводят их концентрацию до 2-106/мл и определяют жизнеспособность, добавляя одну каплю 0,1% раствора трипано-вого синего и одну каплю 0,1% раствора эозина, приготовленных на двойном растворе Хенкса или Рингера на глюкозе (ядра мертвых клеток будут окрашены в синий цвет, а цитоплазма — в вишневый, живые клетки останутся бесцветными). В норме число окрашенных клеток не должно превышать 1—3% [Новиков Д. К. и др., 1979].
Полученную клеточную взвесь либо сразу используют, либо разливают в ампулы по 1 мл, добавляют защитную среду, запаивают, замораживают по специальной программе и хранят в жидком азоте (—196 °С), размораживая по мере надобности. Срок хранения лимфоцитов в замороженном состоянии практически неограничен, по нашим наблюдениям, проведенным совместно с Г. И. Когутом, даже спустя 17 лет число жизнеспособных лимфоцитов заметно не снижается, и они могут быть использованы во всех иммунологических реакциях.
Практика также показывает, что после снятия лимфоцитов фиколл-верографиновую смесь можно использовать повторно, что создает определенную экономию дорогостоящих реактивов {исследование выполнено в нашей лаборатории совместно с Т. Н. Присяжнюк). Нужно только каждый раз добавлять 0,1— 0,2 мл смеси до объема 2 мл.
Методика приготовления тканевых антигенов известна давно. Она описана во всех руководствах и стала классической.
Кусочки ткани берут либо у живого наркотизированного животного, либо сразу же после эвтаназии, строго соблюдая правила асептики. Их тут же охлаждают и все дальнейшие манипуляции выполняют на холоде, используя охлажденную посуду, инструменты и реактивы.
Ткань измельчают ножницами и промывают изотоническим раствором хлорида натрия до полного удаления следов крови. Затем переносят в фарфоровую ступку с кварцевым песком (можно использовать кусочки стекла от битой термостойкой посуды), добавляют несколько миллилитров изотонического раствора хлорида натрия и тщательно растирают до получения гомогенной однородной массы. Ее переносят в колбу, в соотношении 1:2 — 1:4 разводят изотоническим раствором хлорида натрия, перемешивают и отстаивают при +4°С в течение 16—20 ч. Отсасывают надосадочную жидкость (предварительно можно подвергнуть гомогенат и жидкость центрифугированию 15—20 мин при 1500—3000 об/мин, используя центрифугу с охлаждением), по Лоури или ми-
119
кробиуретовым методом определяют содержание белка в 1 мл, разливают в ампулы, герметизируют и хранят в замороженном состоянии. Каждая порция антигена после оттаивания должна быть использована полностью и повторному замораживанию не подлежит.
Учитывая, что в лабораторных условиях применяют центрифуги самых различных конструкции, для получения сравнимых результатов при определении нужной скорости вращения ротора пользуются не показателем числа оборотов в минуту, а показателем величин центробежной силы g. При известном значении g для перевода его в показатель числа оборотов в 1 мин применяют
g-105
формулу: N —--- , где N — число оборотов ротора в минуту, g — центро-
1,1 1\
бежная сила, R — расстояние от центра оси центрифуги до поверхности жид^ кости в пробирке или границы раздела жидкостей.
В заключение этой главы следует еще раз подчеркнуть, что описанными здесь методиками отнюдь не ограничивается огромный арсенал методов исследования, известных в настоящее время. Тем не менее эти методы, с нашей точки зрения, составляют основу для нормальной работы лаборатории экспериментальной хирургии, значительно облегчая проведение исследований и освоение других, более сложных и возможно более информативных методик.
Для упрощения обучения персонала лаборатории, демонстрации объема ее работы и в методических целях целесообразно составить (своеобразную картотеку методик) с тем, чтобы им всегда можно было воспользоваться при проведении соответствующего исследования.
Часть вторая
ХИРУРГИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ
ЗАБОЛЕВАНИЙ И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
«...в любой научной области... надо исходить из данных нам фактов, стало быть, ... .и в теоретическом естествознании нельзя конструировать связи и вносить их в факты, а надо извлекать их из фактов и, найдя, доказывать их, насколько это возможно, опытным путем».
Ф. Энгельс. Диалектика природы.
Маркс К., Энгельс Ф. Соч., 2-е изд., т. 20, с. 370—371.
Глава 6
МОДЕЛИРОВАНИЕ ВОСПАЛЕНИЯ И ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ
Воспаление относится к числу основных реакций организма на воздействие раздражающих агентов, зачастую определяющих течение заболевания и его исход. Эту филогенетически наиболее древнюю и универсальную реакцию на изменения гомеостаза изучают уже не одно столетие, но спорных вопросов остается еще немало, включая и неопределенность дефиниции воспаления, что само по себе говорит о нерешенности проблемы. В монографии «Воспаление» А. М. Чернух предлагает следующее, хотя и сложное, но, по нашему мнению, все же одно из наиболее удачных определений: «Воспаление — это возникшая в ходе эволюции реакция живых тканей на местные повреждения; она состоит из сложных поэтапных изменений микроциркуляторного русла, системы крови и соединительной ткани, которые направлены в конечном итоге на изоляцию и устранение повреждающего агента и восстановление (или замещение) поврежденных тканей» 16.
