Антибактериальные лекарственные средства. Методы стандартизации препаратов - Хабриев Р.У.
ISBN 5-255-04072-1
Скачать (прямая ссылка):
8.5. Определение концентрации антибактериальных препаратов микробиологическим методом
Как известно, одним из факторов, определяющих возникновение фармакологического эффекта, его выраженность и продолжительность, является концентрация лекарственного вещества около специфических рецепторов, т. е. в сыворотке, тканях или органе-мишени. Поэтому для оценки фармакокинетики лекарственного средства (JIC) используют определение его концентрации в различных биологических средах организма и последующее исследование фармакокинетических параметров. Определение концентрации JIC можно проводить с использованием различных методов: спектрофотометрического, радиоизотопного, иммуноферментного, иммунофлуорес-центного, метода газовой или жидкостной хроматографии и микробиологические методы [1, 4, 5].
В настоящее время наиболее часто используются иммуно-ферментный и хроматографические методы анализа [5]. Им-муноферментный метод чаще других используется для проведения терапевтического лекарственного мониторинга (регулярного определения концентрации) препаратов, потому что это автоматизированное, малотравматичное для пациента и простое для исследователя определение концентрации JIC. К недостаткам метода можно отнести относительно высокую стоимость анализа и небольшой список ЛС, для которых существуют стандартные наборы. Наиболее точным как в качественном, так и в количественном отношении считается метод жидкостной хроматографии. Данный метод более универсален но, в то же время, более затратен.
Определение концентрации антибактериальных препаратов можно проводить несколькими методами: иммунофермент-ный метод используется для проведения мониторинга препаратов, характеризующихся прямой корреляцией между концентрацией и эффектом (аминогликозидные антибиотики, ванкомицин); метод жидкостной хроматографии или микробиологические методы — в исследовательских целях для моделирования фармакокинетических процессов.
В настоящее время микробиологический метод определе-
326
ния концентрации антибактериальных препаратов по-прежне-му остается актуальным, так как он является универсальным методом. С его помощью можно определить концентрацию любого антибиотика в любых биологических жидкостях (кровь, моча, спинномозговая жидкость и т. д.) и тканях (мышцы, органы и т. д.) организма. К относительным недостаткам метода можно отнести длительность получения результатов: при определении концентрации методом диффузии в агар ответ получают через 18 ч [1, 2].
Микробиологический метод анализа основывается на способности антибиотиков задерживать рост микроорганизмов. Он базируется на сравнении степени подавления роста тест-микроба известными концентрациями препарата с подавлением роста концентрациями антибиотика в исследуемом материале. При этом подавление роста тест-микроба происходит за счет диффузии антибиотика в плотную питательную среду [1]. Для выполнения данного метода можно использовать различные модификации [2, 3]. Скорость диффузии в агар зависит от класса антибиотика (его химической структуры), состава и pH агаровой среды, буфера, температуры и времени инкубации. Поэтому для определения концентрации антибиотиков микробиологическим методом подбирают оптимальные условия, обеспечивающие максимальную диффузию препарата в агар и четкость зон задержки роста микроорганизмов (табл. 8.1).
Для определения концентрации антибиотика микробиологическим методом вначале необходимо подготовить исследуемый материал для проведения анализа.
Если в качестве биологической пробы берется кровь, то после образования сгустка ее центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 2500-3000 об/мин и сыворотку отделяют. В дальнейшей работе используют полученную сыворотку.
Если в качестве биологической пробы берется ткань, то ее готовят к работе в соответствии со следующими требованиями:
I — определяют массу образца;
II — при определении концентрации антибиотиков в жировой ткани, необходимо ее образцы на 24 ч залить стерильным изотоническим раствором натрия хлорида в объеме, равном массе данного образца, для определения концентрации используется получаемая вытяжка;
III — при определении концентрации антибиотиков в мышечной ткани к образцу добавляют раствор фосфатного буфера (pH = 7.0) и 25 % раствора трихлоруксусной кислоты в объемах, равных полученной массе образца, и гомогенизируют [2]. Кроме данного метода, для гомогенизирования полученного образца можно использовать метод его растирания с кварцевым песком с добавлением раствора фосфатного буфе-
327
pa (pH = 7.0) [1]. Далее полученный гомогенат центрифугируют в течение 15 мин при скорости в 3000-5000 об/мин. Для определения концентрации используется надосадочная жидкость [3].
После соответствующей подготовки образцов приступают к приготовлению плотной питательной среды. Для этого используют или двухслойный агар, или однослойный питательный агар, разлитый в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности. Для нижнего слоя, как правило, используют 15 мл «голодного» незасеянного агара, для верхнего или одного слоя —5-15 мл питательного агара (пропись зависит от группы антибиотика), предварительно зараженного тест-микробом, в соответствии с температурой, группой антибиотика и посевной дозой.
