Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
1*пг:. 2U-5. Электронная микрофотография нескольких молекул очнщоннои ДНК вируса иолиомы. (С люисмного разрешения д-ра Стоксниуса, Рокфеллеровский институт.) Отчетливо видно, что все люлекулы имеют кольцевого форму. Длина каждой такой молекулы — 1,0 мкм, что соответствует мол. несу 3-10®.
Рис. 20-6. Хроматино подобная структура кои- 1 плексов гпетон — ДНК вируса SV10, выде- I ленных из частиц вируса SV40. (С любезного разрешения д-ра Кремези, д-ра Пинаттгт, д-рв i Круассана и д-ра Я пива, Пастеровский инсти- I tvt, Париж). Плотпые тельца соответствуют J нуклеосомам хроматина эукариотов.
f 1м некрипции
(рлшис ф.хнкшш) Обошачения ",.у1 н kf~ I РНК K&W»# Белок
Рис. 20-7. Л. Схематическое и.тбражеиие вируса SV40, 72 капсомера которого расположены икосаэдр ичесии. Б. ГСольцекая хромосома вируса SV40 (или пнруся иолиомы); указапы т|»и
гена, точки инициации репликации ДНК «особенности транскрипции ранних и поздних генов.
ЛН.'ШС II ТРАНСФОГМА ЦИЯ
Когда вирус SV40 проникает в восприимчивую клетку обезьяны, он обычно бесследно исчезает Реже (приблизительно с частотой 10 -) он размио жается как обычный иирус, лродуцир\я большое- количество новых вирусных частиц. Местом окончательного созревания в клетке хозяине является ядро, которое в итоге окалывается заполненным дочерними частицами в огромном количестве (приблизительно 10°). Во время .ггого процесса, который занимает от 24 до 48 ч при темпера туре 37 С, нормальные ф>як-ции ядра постепенно нарушаются, и инфицированная клетка обязательно погибает (литическая инфекция). Между тем никакого потомства не образуется, если частица вируса SY40 пропинает в клешу мыши или хомячка. При йтом весьма незначительная доля инфицированных клеток (—10 г>) трансформпруется в морфологически отличимые раковые клегки.
Как лизис, так и реакции трансформации можно наблюдать вне живых организмов, в культуре клеток. Культуру клеток (чагто полученную от :>мбриопов) выращивают на стекле, погруженном в питательный раствор. Затем к ней добавляют вирусные частицы. Некоторые из частиц размио ж» юте я в клетках с образованием потомства, которое затем адсорбируется соседними клетками — образуется круглое пятно из погибших клеток, похожее на стерильные пятна в случае бактериальных вирусов (рис. 20-8). Если же одну из клеток е культуре вирус трансформирует, то она начинает беспорядочно размножаться, что позволяет легко идентифицировать ее как раковую (рис 20-9). Главной отличительной особенностью трансформированных клеток является их беспорядочный рост, который приводит к образованию групп клеток, хаотически нагроможденных одна на другую.
Рпс. 20-8. Бляшки, образованные вирусом полпоыы (Crawford, Diamond, Viroluey, 22, 235, 1964.1.
Препарат вируса добавляют к клеткам мышиного эмбриона, растущим на поверхности (текла Пляшки, которые становятся видимыми поело 25 дней инкубации,— это пло!ные массы убитых клеток, окрашивающихся иначе, нежели живые растущие клетки.
Рис. 20 9. Клоны, образованные трансформированными (слева) и нормальными (справа) клетками мышиного эмбриона. (С любезного разрегаеппя д-ра Стоукера, Институт вирусологии, Глазго, Англия.) Трансформированные клетки громоздятся друг на друга, образуя более плотную (более темную) массу, чем нормальные клетки.
НЕГМИССИВНЫЕ И НЕПЕРМИССИВНЫЕ КЛЕТКИ
Клетки, в которых данный вирус способен размножаться, называются нермиссивиыми, а клетки, в которых рост вируса невозможен, носят название нспсрмиссивных. Линия пермиссивных клеток обычно ведет свое происхождение от животного, в котором в норме репродуцируется данный вирус, линии же непермиссивных клеток обычно происходят от животных, it организме которых вирус размножаться не способен. Таким образом, it зависимости от вируса та или иная клетка может быть либо пермиссив ной, либо пепермиссивной. Например, очень хорошо известная линия ЗТЗ мышеи оказывается пермиссивной для кируса полиомы мыши, но непер-мнеенвной для вируса обезьян SV40. Если клетки ЗТЗ заразить вирусом SV40, то последний не станет в них размножат ьгя, но иногда может вызвать трансформацию клеток. Точно так же, когда вирусом полиомы заражают пспермиссивную клеточную линию ВНК (почки хомячка), он может трансформировать клетку, но размножаться не способен; поэтому клетки ВНК часто используются в опытах по трансформации вирусом полиомы.
ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ ДНК ВИРУСА SV40
В настоящее время расщепление молекул ДПК на мелкие фрагменты определенной структуры является обычной процедурой. Под действием ресгрн -кгаз происходит разрыв дву хцепочечной молекулы ДНК в середине определенных пог.ледоиател ыюстеп. Один из ферментов рестрикции, рестрикта-ta R! из Е. coli (Есо П1) узнает последовательность
ГААТТЦ
ЦТЧ’ААГ.
которая в ДНК вируса SV40 встречается только один раз. Этот фермент превращает кольцевую ДНК вируса SV40 в лнненную палочкообразную молекулу, концы которой имеют строго определенную последовательность (рис. 20-10). Другие рестриктазы распознают в ДНК вируса SV40 более чисто встречающиеся последовательности; поэтому в результате их действия образуется большее число отдельных фрагментов. Например, смесь рестриктаз из Hemophilus influenzae вызывает разрывы в 11 сайтах, тогда кик ферменты из Hrmnphi.lus parainflucnzae катализируют только три разрыва. Установить порядок отдельных частей в молекуле ДНК можно, анализируя состав более крупных фрагментов, образующихся при неполном расщеплеинп. Этот порядок уже удалось установить (рис. 20-11). Поэтому, если учесть успехи в определении нуклеотидных последовательностей отдельных фрагментов, можно надеяться, что в течение ближайших ют будет полностью расшифрована пси последовательность нуклеотидов ,—-48011) ДПК вируса SV40.
