Молекулярная биология гена - Уотсон Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Полученные t помощью Есо Ш линейные молекулы ДПК впруса SV40 можно характеризовать далее посредством картировапия методом неполной денатурации. Этот метод основан на том, что молекулы ДНК с высоким содержанием пар оснований А - I денатурируют быстрее, чем ДНК, богатые более устойчивыми парами Г — Ц. Поэтому, когда ДНК вируса SV40 подвергают частичной денатурации щелочью, участки с высоким | одержанием А — Т расходятся, а участки с высоким содержанием Г — Ц остаются интактными. На электронных микрофотографиях в таких молекулах видяы одноцепочечиые области в виде «пузырей», связанных между собой дву.хцепочечпыми линейными участками (рис. 20-12) Структуры, образующиеся при такой обработке, хорошо воспроизводимы; по картинам, которые получаются при этом, легко отличать одну ДНК от другой.
Рис. 20-10. Диаграмма, на которой представлены основные последовательности, узнаваемые некоторыми рсстриктазами. Стрелками указаны места разрыва цепи. Ферменты из Hemophilus influenzae d II и из Н. parainfluen-zae (Нра 1) разрывают обе цепи в одном и том же месте. Ферменты из Е. coli (Eco R1) н ii //- influenzae d HI (Hind III) делают разрывы в разных местах, после чего образуются |мт с липкими концами. Указанные после-.'•шательности1оенованип представляют собой алиндромы относительно центральной точки в каждой из пих.
Eco R1
Нра 1
Hindm
Hind П
*43 !0jZb&S-llb^
^4IHZHZ]|[i№HZb5,
^4ZHZHZKZHZ]|[Z]-^
s'
Обозначения:^ДНК1тЕсоК1.> Пр1,| ETlHindlll
Рис. 20-11. Места разрывов хромосомы вируса SV40 под действием некоторых широко используемых рестриктаз.
1равните;пх с разрывом под действием фер-ненга Eco R1, показанного на генетической карте (рис. 20-7).
\ :
X ¦'
’ 'х/
Дм * ,
i 0,5
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Д пина ДНК. ui пиит стьные елимииы
Рис. 20-12. А. Электронно-микроскопическое Дслиуса.) Б. Гистогралша нашвяых областей, изображеппе ДНК вируса S V4 0, превращен- обнаруженных на олектрошти ылирифотог-
noii в линенную форму под действием андо- рафии липенпой ДНК вируса S\40, >пред
пуклеазьг R1 и частично денатурированном ставлевной в (Л). (С разрешения д-ра Малдера
при pH 10,9. (С любезного разрешения д-ра п д-ра Делиуса.)
Ш1ФЕКЦИ1)НН1)СТЬ ДНК ВИРУСА SV40
Добавление высокоочищенной ДНК к пермиссивным или непермисснв-ным клеткам приводит соответственно либо к литической, либо к трансформирующем реакции. Однако частота нозникнонения этих реакций при добавлении интактных вирусных частиц на несколько порядков выше, нероятно потому, что свободные молекулы ДНК с трудом адсорбируются па клотке-хозяине. Если все же молекулы свободной ДНК индуцируют инфекционный процесс (или трансформацию), то конечный эффект нельзя отличить от аффекта, вызываемого зрелыми вирусными частицами. Нтот факт еще раз свидетельствует о том, что носителем гепетической специфнч пости является только ДНК.
ИА РАННЕП СТАДИИ ЖНЛНГСНН01 О ЦИКЛА ПРЕОБЛАДАЕТ СИНТЕЗ Т-АНТИГЕНА
Жизненный цикл вируса SV4U, так же ка]; и у фагов, можно подразделить на рапшию и позднюю стадии. На ранней стадии, продолжающейся примерно 8—10 ч, подготавливается синтез ДНК и структурных белков вируса SV40, который происходит на поздней стадии. Сначала считапи, что на ранней стадии синтезируется ряд вирус-специфических ферментов. Однако в настоящее время мы располагаем фактами, свидетельствующими о том, что вначале синтезируется, вероятно, только один ЯУ40-специфическин белок. Этот белок назван Т-антигеном (рис. 20-13). Вскоре после синтеза в цитоплазме он транспортируется в ядро. До сих пор ничего нельзя сказать о его физических свойствах, так как при осторожном способе выделения он ведет себя как крупная молекула (мол. вес более 50U 000). а при менее щадящем мол. вес итого белка оказывается равным ~75 000.
Ранняя мРПК, кодирующая Т-антиген, имеет константу седиментации 19S и характеризуется мол. весом~800 U00. Она синтезируется к направлении против часовой стрелки (когда хромосома вируса SV40 ориентирована так, как показано на рис. 20-7) с «е»-цспп (от англ. early — ранний). Общая кодирующая способность этой мРНК к лучшем случае соответствует 7Л0 аминокислотам, что более или менее совпадает с длиной цепи меньшей
Рис. 20-13. Демонстрация наличия ядсрного ацтигрна. специфичного к ви русу SV40 (с помощью иммунофлуоррс-црптного метода) в ненермиссивных клетках хомячка, трансформированных вирусом SV40. (С любезного разрешения д ра Дефенди, Вистаровскин институт, Филадельфия.)
формы Т-антигена. Отсюда следует, что более крупная форма Т-4\нтиген« тбо представляет собой агрегат нескольких идентичных полпнентндов Т-антигеяа, либо возникает в результате прикрепления Г-антигена к значительно бн. гее крупной молекуле одного из клеточных белков.
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДОКАЗАТЕЛЬСТВА НАЛИЧИЯ ТРЕХ ГЕНОВ В ДНК ВИРУСА SV40 (НОЛИОМЫ)
За последние 5 лет с помощью обработки азотистой кислотой было изолировано множество различных температурочувствителышк мутантов вируса SV<0 (нолиомы). Как оказалось, эти мутанты распадаются только ни три группы комплементации, причем две из них соответствуют поздним генам, кодирующим дна структурных белка вируса SV40 - VP1 и VP2. Третью группу можно соотнести с раиннм геном, кодирующим Т-антиген. В мутаи тах блокируется не только накопление Т антигена, по и репликация ДНК и синтез структурных белков вируса SV40. Кроссинговер и данном c.ijчае наблюдается редко, поэтому установить порядок расположения утих генов только при помощи генетического подхода оказывается невозможным. Однако данные экспериментов, в которых для комплементации с темпера-турочувстяительными мутантами из разных групп использовались малые фрагменты ДНК, полученные при действии рестрнктаз, позволили установить точный порядок генов в ДНК вируса SV4U (рис. 20-14).
