Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Гл. 3. Хроматографические методы 111
поверхностно-активных веществ. Сорбция этих веществ на «активных участках» мембран, по-видимому, вызывает изменение их адсорбционных и электрохимических свойств. В отличие от целлюлозных мембран ультрафильтры диафло представляют собой анизотропные мембраны, состоящие из очень тонкой, но прочной пористой пленки-оболочки с заданным размером пор, которая прикреплена к более толстой губчатой подложке из того же полимера с постепенно расширяющимися отверстиями. Благодаря такой необычной структуре мембран поры почти не засоряются, что обеспечивает высокую скорость прохождения раствора через мембрану. Мембраны применяются исключительно для ультрафильтрации и выпускаются с различным диаметром пор.
Диализ. Чтобы удалить из исследуемого раствора молекулы растворенного вещества, его помещают в целлюлозный мешочек и погружают в чистый растворитель (воду или буферный раствор). Малые молекулы будут выходить из мешочка в растворитель до > тех пор, пока их концентрации по обе стороны мембраны не выравняются. Для ускорения диффузии площадь поверхности диализного мешочка делают как можно большей, помня, однако, о возможной потере макромолекул в результате сорбции их на мембране, а слои раствора, примыкающего к мембране, постоянно заменяют, Перемешивая растворитель, а иногда и раствор. Рекомендуется также регулярно, а еще лучше непрерывно сменять растворитель.
Если осмотическое давление в исследуемом растворе и растворителе неодинаково, то по мере выхода из диализного мешочка растворенного вещества молекулы чистого растворителя будут проникать внутрь мембраны (явление осмоса), что приведет к разведению исследуемого раствора.
Растворы макромолекул можно концентрировать путем диализа против растворов высокомолекулярных веществ, таких, например, как полиэтиленгликоль (карбовакс). Диализный мешочек с раствором можно также подвешивать в струе воздуха; в этом случае молекулы растворителя, выходя из мембраны, испаряются, а растворенное вещество, также выходящее из мембраны, скапливается на наружной поверхности мешочка, откуда его периодически удаляют промыванием.
Ультрафильтрация. Разность давлений по обе стороны мембраны создается путем повышения давления со стороны фильтруемого раствора или понижения его в ультрафильтрате. Фирменные приборы для ультрафильтрации состоят из камеры особой конструкции, в которой создается положительное давление, и, как правило, снабжены магнитными мешалками. При ультрафильтрации небольших объемов материала (в клинических лабораториях) разность давлений может создаваться при центрифугировании образца. Ульт-рафйльтрацию можно проводить непрерывно и фильтровать большие объемы.
112 Часть II. Методы разделения
При обычной ультрафильтрации уменьшение общего объема не приводит к существенному изменению концентрации малых молекул растворенного вещества в удерживаемой жидкости. Повысить скорость обессоливания раствора можно за счет многократного или непрерывного разведения раствора свежим растворителем. Этот метод иногда называют диафильтрацией.
Электродиализ. Принципиально этот метод сходен с электрофорезом, с той лишь разницей, что движение макромолекул ограничивается мембраной. Существует целый ряд приборов для электродиализа, различающихся расположением электродов и типом применяемых мембран (гл. 4).
3.11.3. Разделение с помощью полых волокон
Ячейки типа биофайбер и диафайбер состоят из пучка длинных полых волокон с внутренним диаметром порядка 200 мкм. Рабочая поверхность каждого из таких волокон — около 1 см2. Волокна с закрепленными в специальном патроне концами погружают в чистый растворитель; диализируемый раствор поступает внутрь волокон. Обессоливание растворов происходит очень быстро — на 99% менее чем за 1 ч. С помощью данного метода можно быстро концентрировать растворы. Для этого исследуемый раствор помещают снаружи волокон, а затем создают разность давлений либо за счет частичного вакуума внутри волокон, либо за счет повышения давления в самом растворе. Скорость концентрирования превышает 100 см3-мин-1. Интересно отметить, что данный метод может с успехом применяться для концентрирования выходящих из колонки элюатов. С помощью полых волокон можно быстро и легко восстанавливать до исходной концентрации растворы веществ, которые подверглись разведению в ходе разделения на колонке. Это особенно важно при работе с такими термолабильными соединениями, как белки и нуклеиновые кислоты.
Полые волокна выпускаются с отверстиями различных диаметров, что позволяет использовать их для фракционирования веществ, например для очистки аминокислот от белков. Они широко применяются для концентрирования плазмы крови и вирусных препаратов, а также при изучении связывания лекарственных веществ с сывороточным альбумином.
3.12. Рекомендуемая литература
Cuatrecasas P., Affinity chromatography of macromolecules. In Advances in Enzymology. Ed. by Meister, A., 36, 29. Interscience, New York (1972). (Подробное описание аффинной хроматографии.)
Friedberg F.,' Affinity chromatography and insoluble enzymes. Chromato-' graphy Reviews, 14, 121 (1971). (Сведения, о несолюбилизироваиных
