Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
После элюирования из колонки всех компонентов исследуемого вещества гель можно использовать для дальнейших экспериментов без дополнительной регенерации.
Гл. 3. Хроматографические методы 99
3.7.5. Тонкослойная гель-фильтрация (ТГФ)
Тонкослойная гель-фильтрация имеет ряд общих черт с TCX, но между ними имеется также и существенное различие. При ТГФ слой набухшего геля наносят на поверхность стеклянной пластинки. Гранулы геля прилипают к пластинке без добавления закрепляющих агентов, образуя неподвижную фазу; подвижной фазой является буферный раствор. В отличие от TCX, при ТГФ слой геля не должен подсыхать; следовательно, в ГТФ «фронт» растворителя отсутствует. Пластинку для ГТФ помещают в герметичную камеру и соединяют с обеих сторон с резервуарами при помощи «мостиков» из фильтровальной бумаги.Пластинку устанавливают под углом 20°, что облегчает прохождение подвижной фазы через слой. Для уравновешивания требуется не менее 12 ч. Цель уравновешивания — установить правильное соотношение между объемами подвижной и неподвижной фаз. Пластинку можно располагать горизонтально, а резервуары с растворителем помещать на разной высоте, благодаря чему будет обеспечиваться ток растворителя. Пробу наносят в виде пятна или полосы, а затем в течение определенного времени проводят хроматографирование.
В то время как TCX применяют в основном для разделения аминокислот, сахаров и олигосахаридов, алкалоидов, стероидов и липо-фильвых соединений, ТГФ используется для анализа высокомолекулярных гидрофильных соединений — белков, пептидов, нуклеиновых кислот, требующих более тонкой процедуры разделения.
Основным преимуществом ТГФ перед гель-фильтрацией на колонке является то, что она позволяет хроматографировать в одинаковых условиях одновременно несколько проб, а также разделять очень малые количества материала, что делает ее незаменимой "в клинических лабораториях.
3.7.6. Применение проникающей хроматографии
Очистка вещества. Проникающая хроматография используется в основном для очистки высокомолекулярных биологических соединений. С помощью соответствующих гелей или стеклянных гранул проводят разделение и очистку вирусов, белков, ферментов, гормонов, антител, нуклеиновых кислот и полисахарвдов. Методом проникающей хроматографии можно разделять смеси низкомолекулярных соединений, отделять аминокислоты от пептидов, фракционировать пептиды, образующиеся в результате частичного гидролиза белков, а также олигонуклеотиды из гидролизатов нуклеиновых кислот. Используя данный метод, можно выделять низкомолекулярные декстраны из смесей, например из кукурузного масла.
Определение молекулярных весов. Установлено, что в широком диапазоне молекулярных весов объем элюата глобулярных белков
100 Часть Н. Методы разделения
линейно зависит от логарифма молекулярного веса. На основании этого строят калибровочную кривую для белков с известным молекулярным весом и структурой, аналогичной структуре исследуемых белков, и с помощью этой кривой определяют молекулярные веса неизвестных белков.
Концентрирование растворов. Растворы высокомолекулярных соединений можно концентрировать путем добавления к ним сух#го сефадекса G-25 (грубого). Набухающий гель поглощает воду и низкомолекулярные соединения, а вещества с большим молекулярным весом остаются в растворе. Спустя 10 мин гель удаляют центрифугированием; при этом pH и ионная сила раствора остаются неизменными. Л
Обессоливание растворов. С помощью колонки, заполненной сефадексом G-25, можно проводить обессоливание растворов высокомолекулярных соединений. Фракции высокомолекулярных соединений элюируются с внешним объемом колонки, в то время как фракции, содержащие низкомолекулярные соединения, распределяются между подвижной и неподвижной фазами и поэтому движутся с меньшей скоростью. Обессоливание — более быстрый и эффективный метод, чем диализ, и используется, в частности, для удаления фенола из растворов нуклеиновых кислот, сульфата аммония из растворов белков, а также для отделения моносахаридов от полисахаридов и аминокислот от белков.
Первоначально сефадексы применяли только в гель-фильтрации, однако в настоящее время имеются их модификации, которые с успехом используются как ионообменные смолы. К ним относятся: ДЕАЭ-сефадекс (слабоосновный), КМ-сефадекс (слабокислый) и SE-сефадекс (сульфээтил, сильнокислый). Эти виды сефадексов также бывают с разным числом поперечных связей; разделение веществ с их помощью основано на ионном обмене и гель-фильтрации.
3.8. Аффинная хроматография
3.8.1. Принцип метода
Очистка высокомолекулярных биологических соединений методом аффинной хроматографии основана на уникальном свойстве макромолекул — их биологической специфичности. Именно благодаря этой особенности с помощью аффинной хроматографии теоретически можно получать абсолютно чистые вещества в отличие от таких методов разделения, как проникающая хроматография и электрофорез, основанных на физико-химических свойствах макромолекул (которые у отдельных молекул могут быть практически одинаковыми).
