Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Крахмальные гели. Крахмальные гели готовят путем нагревания и охлаждения смеси частично гидролизованного крахмала с соответствующим буфером. Это приводит к переплетанию разветвленных цепей молекул и образованию полужесткой структуры. Буфер для крахмальных гелей, как правило, подбирают эмпирически, й для этой цели с успехом применяют целый ряд разных буферов, «Слабые», высокопористые гели можно приготовить, добавляя к буферному раствору менее 2% (весовые проценты) крахмала, а
Гл. 4. Электрофорез 123
«сильные», низкопористые — от 8 до 15%. Точный размер пор образующихся при этом крахмальных гелей определить, однако, не удается.
Гели обычно наносят на прямоугольные пластины из плексигласа, размеры которых зависят от того, в каком положении — горизонтальном или вертикальном — будут проводить разделение. Типичные размеры пластин для горизонтального электрофореза — 20x10x0,6 см, а для вертикального — 25x12,5x0,6 см. Перед использованием пластины с гелями выдерживают при 0—4° С.
Наибольшее применение крахмальные гели для электрофореза нашли при разделении сложных смесей структурных и физиологически активных белков.
Агар — это смесь двух галактозных полимеров, агарозы и агаро-пектина. Их концентрация в геле равна всего 1 %, т. е. агар содержит большое количество воды, вследствие чего ионы в процессе электрофореза движутся очень быстро. Благодаря этому свойству агар очень удобен для разделения и обнаружения антигенов методом иммуноэлектрофореза (разд. 4.4.4).
Полиакриламидный гель. Полиакриламидные гели обладают рядом свойств, благодаря которым они особенно успешно применяются для разделения макромолекул:
а) размер пор у них можно варьировать в широких пределах;
б) их можно формовать в калиброванных трубках и, следовательно, получать воспроизводимые результаты;
в) их можно применять с самыми разными буферами;
г) разделение проходит очень быстро;
д) адсорбция и электроосмос низки;
е) они не поглощают ультрафиолетовый свет при 270 нм, и, следовательно, местоположение белков после разделения можно определить по поглощению при этой длине волны;
ж) после разделения макромолекулы можно окрашивать и определять количество вещества с помощью денситометра. .
Полиакриламидные гели получают при сополимеризации акрил-амида
О
В
сн2=сн—с—nh2
и N, N'-метилендиакриламида [CH2(NHCOCH =СН2)г1 в присутствии соответствующего свободнорадикального катализатора.’ Этот катализатор обычно представляет собой смесь 0,1—0,3% (весовые проценты) персульфата аммония либо с 0,1—0,3% р-диметиламино-пропионитрилом (ДМАП), либо с N,N,N',N'-тетраметилэтилен-диамином (ТМЭД). Пористость геля определяется соотношением между акриламидом и соединением, образующим поперечные связи. На рис. 4.3 показана сетчатая структура геля.
124 Часть II. Методы разделения
Мономеры и катализатор сначала смешивают в буфере, а затем заливают в цилиндрические трубки из стекла или плексигласа диаметром 5—6 мм и длиной 6—7 см. Трубки закрывают снизу резиновыми колпачками и ставят вертикально в штатив. Процесс полимеризации ингибируется кислородом, и, чтобы избежать этого, на поверхность геля осторожно наслаивают дистиллированную воду на высоту нескольких миллиметров. Это наслаивание обеспечивает
KH2=CHCONH2-] + CH,(NH COCH==CH8)g
ЫМ-мвтштбштрижшид (Моднорадикальный катализатор
х
Рис. 4.3. Образование полиакриламидного геля.
также образование плоской поверхности у верхнего конца столбика геля. Наслаивание осуществляют либо с помощью шприца для подкожных инъекций, либо через капилляр с продетым в него хлопчатобумажным волокном. Вода стекает из капилляра по волокну и равномерно растекается по поверхности плотного полиакриламидного раствора.
Можно приготовить гели с общим содержанием акриламида от 3 до 30% (весовые проценты), что соответствует размерам пор от
0,2 до 0,5 нм. Чем меньше процентное содержание акриламида, тем крупнее поры и тем меньшее сопротивление оказывает гель прохождению больших молекул. Для разделения веществ с мол. весом около 104 дальтон применяется 30%-ный гель, а для веществ с мол. весом более 10е дальтон — гель с 3%-ным содержанием акриламида.
4.3.3. Ход работы
Насыщение носителя. Если носитель не является гелем, для обеспечения электропроводности его необходимо насытить буфером до начала электрофореза. Насыщение лучше производить до нанесения образца, иначе это с самого начала приведет к его размыва-
Гл. 4. Электрофорез 125
нию. Хроматографическую бумагу погружают в буфер и удаляют избыток влаги промоканием. Полосы бумаги из ацетата целлюлозы пропитывают буфером, предоставляя им возможность плавать по поверхности буфера в плоском сосуде (при быстром погружении бумага захватывает пузырьки воздуха, которые потом трудно удалить). Тонкослойные среды лучше всего насыщать, используя их капиллярные свойства, как описано в разд. 4.3.2.
Нанесение образца. Раствор с образцом обычно наносят микропипеткой в виде маленького пятна или узкой полосы. Если отдельные компоненты смеси имеют противоположные заряды, они в ходе разделения будут двигаться к разным электродам, и образец в этом случае нужно наносить примерно посередине. Если же все компоненты будут двигаться в одном направлении, т. е. если все они заряжены либо положительно, либо отрицательно, образец нужно наносить как можно дальше от соответствующего электрода, у противоположного конца носителя, чтобы разделяемые компоненты проходили возможно большее расстояние. При горизонтальном электрофорезе пропитанные образцом полоски фильтровальной бумаги вводят в щель или ямку, вырезанные на поверхности геля. При вертикальном электрофорезе образец в 10%-ном растворе сахарозы наслаивают на поверхность вертикального столбика геля. Изредка образец включают в широкопористый гель, называемый гелем образца.
