Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
До настоящего времени аффинная хроматография применялась в основном для очистки белков, но ее в равной степени можно ис-
Гл. 3. Хроматографические методы JOI
\
пользовать и для очистки антигенов и антител, витаминов и гормонов, белков, связывающих лекарственные вещества, рецепторов лекарственных веществ, транспортных белков, полирибосомальных и полиферментных комплексов и репрессоров.
Характерной особенностью третичной структуры ферментов .является то, что их активный центр и регуляторный участок (один или несколько) взаимодействуют лишь с небольшим числом соединений (лигандов), которые являются либо субстратами, либо эффекторами обратимого или необратимого типа. Очистка ферментов с помощью аффинной хроматографии основана на специфическом узнавании этих участков и возможна лишь в том случае, если активный участок обладает высоким сродством к лиганду, если связывание лиганда с участком- обратимо и если в данных условиях после сшивания лиганда с матрицей никакой другой реакции не происходит.
Сначала лиганд, который обычно представляет собой конкурентный обратимый ингибитор, ковалентно сшивают с соответствующей нерастворимой матрицей; при этом лиганд не теряет своей способности связываться с ферментом. Затем подлежащий очистке раствор фермента наносят на колонку, заполненную связанной с лигандом матрицей в соответствующем буферном растворе, после чего происходит избирательное связывание фермента. Содержащиеся в ферменте примеси, которые не связались с матрицей, элюируются с колонки; последующую элюцию фермента осуществляют при помощи раствора, содержащего субстрат, в среде с другим pH и (или) ионной силой.
Для разделения веществ методом аффинной хроматографии необходимо точно знать кинетические свойства исследуемого фермента, так как успех анализа прежде всего зависит от тщательной подготовки эксперимента. Экспериментальные условия должны быть максимально приближены к условиям анализа ферментов в обычных изолированных системах.
Следует иметь в виду, что при очистке всех видов макромолекул методом, в основе которого лежит процесс
а+1
М + Л «г мл,
(Макромолекула) (Лиганд) (Комплекс)
эффективность очистки зависит ог рироды образующегося комплекса. По мере нанесения на колонку новых порций раствора исследуемого соединения и в силу обратимости процесса будет происходить связывание других макромолекул, задержавшихся в верхней части колонки и еще не успевших прочно связаться с лигандом. В результате этого увеличивается не только концентрация, но и прочность образующегося комплекса, что в свою очередь повышает эффективность очистки. Благодаря постоянному повышению эф-
102 Часть II. Методы разделения
фективности процесса по мере нанесения на колонку образца, аффинная хроматография неизменно дает лучшие результаты по сравнению с традиционными методами.
3.8.2. Выбор , нерастворимой матрицы
Идеальная нерастворимая матрица для аффинной хроматографии должна удовлетворять следующим требованиям:
а) содержать большое число химических групп, способных ковалентно связываться с лигандом, и при сшивании с ним не разрушаться;
б) не разрушаться при связывании и последующей элюции макромолекул;
в) как можно слабее взаимодействовать с другими макромолекулами, чтобы неспецифическое связывание было минимальным;
г) обеспечивать быстрое протекание растворителя.
Обычно в качестве матрицы применяют однородные твердые сферические гранулы таких соединений, как агароза и поперечно-сшитые декстраны (например, сефароза 4В); применяются также синтетические полиакриламидные гели, производные целлюлозы, полистирольные смолы и пористые стеклянные шарики.
3.8.3. Выбор лиганда и его сшивание с матрицей
Чтобы правильно выбрать лиганд, нужно хорошо знать специфичность подлежащих очистке макромолекул. Лиганд должен содержать определенную химическую группу, которая не участвует в специфическом связывании лиганда с макромолекулой, но посредством которой происходит его сшивание с матрицей. Чтобы в процессе сшивания с матрицей не нарушалась способность лиганда связываться с макромолекулой, целесообразно связывать лиганд с матрицей с помощью удлиняющих «мостиков».
Наиболее распространенный способ пришивания лиганда к матрице заключается в предварительной обработке полисахаридной матрицы бромцианом (CNBr) при pH 11,0 (в продаже имеется активированная бромцианом сефароза 4В).
Бромциан реагирует с гидроксильными группами полисахарида с образованием карбаматных групп, а также с соседними гидроксильными группами (если они имеются) с образованием имидокарбо-натных групп. Одновременно происходит, по-видимому, образование поперечных связей внутри матричной структуры геля, что способствует ее стабилизации. Удлиняющие «мостики» вводят несколькими способами, в частности при помощи диаминов типа ЫН2(СН2)^ЫНг(л: = 2—6) или е-аминокапроновой кислоты. Окончательное сшивание замещенной матрицы с лигандом, который должен содержать определенную реакционноспособную группу (как
