Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
3.10.6. Сбор фракций
Элюируемый с колонки раствор (элюат) собирают в виде небольших фракций, каждая из которых составляет 2—5% общего объема колонки. Фракции обычно собирают в пробирки, так что после
Гл. 3. Хроматографические методы 109
выхода из колонки разделенные компоненты не смешиваются. Каждое соединение обычно распределено по нескольким пробиркам, однако если разделение проведено успешно, число таких фракций относительно невелико и они отделены от других соединений промежуточными фракциями, содержащими ничтожно малые количества разделяемых соединений. Фракции, содержащие одно и то же соединение, объединяют для дальнейшего анализа.
Существует целый ряд автоматических коллекторов фракций, с помощью которых можно собирать определенные объемы элюата в автоматически сменяющие друг друга пробирки. Точное количество элюата в каждой фракции задается несколькими способами. Фракции можно собирать в пробирки либо по заранее заданному объему (с помощью системы сифонов или заменяющих их устройств), либо по числу капель — при помощи специального электронного устройства, контролирующего заполнение пробирок запрограммированным числом капель. Недостаток последнего метода заключается в том, что при изменении концентрации элюата (как это имеет место при градиентной элюции) изменяется поверхностное натяжение капель, а следовательно, и их объем; при этом изменяется также и объем собираемых фракций. Другой способ заключается в том, что элюат собирают в каждую пробирку в течение определенного интервала времени. Однако и в этом случае объем отдельных фракций может быть неодинаковым, так как скорость протекания элюата по колонке не всегда постоянна.
3.10.7. Анализ фракций
Анализ распределения разделенных компонентов в собранных фракциях проводят с помощью методов, позволяющих специфически обнаруживать разделяемые соединения. Очень часто все фракции, число которых может превышать 100, приходится исследовать вручную. Однако, если соединение обладает какими-либо характерными физическими свойствами, например поглощает свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра, выходящий из колонки элюат можно исследовать на содержание в нем данного соединения с помощью соответствующего прибора. Этот метод широко используется при анализе белков и нуклеиновых кислот, поглощающих свет при 280 и 260 нм соответственно. В этом случае элюат отводят из колонки с помощью капиллярных трубок в кварцевую проточную кювету, на которую падает луч света соответствующей длины волны. Изменения поглощения растворов регистрируют фотоэлементом и фиксируют на диаграммной ленте самописца, который можно синхронизировать с коллектором фракций. Таким образом, осуществляется непрерывная запись номеров фракций и количества содержащегося в каждой из них вещества.
110 Часть II. Методы разделения
3.11. Разделение веществ с помощью мембран и полых волокон
3.11.1. Принцип метода
В биохимической практике часто возникает необходимость сконцентрировать водные растворы макромолекул и удалить из них мелкие неорганические ионы. Иногда для этих целей применяют сухой гель, например сефадекс G-25 (разд. 3.7.6), однако самый распространенный способ концентрирования веществ — использование специальных мембран. Такие мембраны обладают хорошей проницаемостью для небольших молекул и практически непроницаемы для крупных. Диффузия небольших молекул через мембраны обеспечивается следующими факторами:
а) разностью концентраций подлежащего удалению вещества в исследуемом растворе и чистом растворителе, находящихся по разные стороны мембраны {диализ)-,
б) разностью гидростатических давлений по обе стороны мембраны, обеспечивающей диффузию молекул растворителя через мембрану (ультрафильтрация);
в) при переносе ионов через мембрану — приложенным внешним электрическим полем (электродиализ).
В каждом из вышеперечисленных случаев раствор диффундирующего через мембрану вещества условно называется ультрафильтратом.
Наиболее часто используемые мембраны — это прозрачные целлюлозные пленки или трубки (например, трубочки из целлофана или микротрубки Вискинга). Недавно были получены мембраны из нецеллюлозных полиэлектролитных комплексов (ультрафильтры диафло, выпускаемые фирмой Amicon Ltd.), полупроницаемые полые волокна из целлюлозы и ацетатцеллюлозы (биофайбер, выпускаемые фирмой Bio-Rad Laboratories) и нецеллюлозные поли-электролитные комплексы (диафайбер, фирма Amicon Ltd.). Полые волокна, аналогично мембранам, также действуют по принципу молекулярного сита, однако обладают по сравнению с ними рядом преимуществ, обусловленных увеличением площади фильтрации за счет увеличения соотношения между площадью поверхности волокон и их объемом.
3.11.2. Разделение с помощью мембран
В продаже имеются целлюлозные мембраны различной степени проницаемости и целлюлозные трубки с различным диаметром пор. Степень пористости мембран можно изменять путем механического растягивания их или обработкой раствором едкого натра, а также за счет добавления к исследуемому раствору следовых количеств
