Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Степанов В.М. -> "Молекулярная биология. Структура и функция белков" -> 26

Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.

Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков — М.: Высшая школа, 1996. — 335 c.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка): strukturifunkciibelkov1996.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 140 >> Следующая

Некоторые аминокислоты вообйф1'не выдерживают кислотного
I
гидролиза и разрушаются практически полностью, поэтому для их определения требуются специально разработанные приемы. Прежде всего полностью гидролизуются до свободных аспарагиновой и глутаминовой Кислот их амиды — аспарагин и глутамин. Методы их прямого определения в белках до сих пор не разработаны. Для определения триптофана гидролиз белка проводят метансульфоновой кислотой СН3—SO3H в присутствии триптамина, защищающего ин-дольное кольцо триптофана от деструкции. Для определения суммы цистина и цистеина белок перед гидролизом подвергают окислению надмуравьиной кислотой НСО—00Hf в результате чего эти остатки превращаются в остатки цистеиновой кислоты: '
г,-
UV-
SH
I
сн2
I
—NH-CH-C0
Цистеин
-NH-CH—СО-
I
сн2
I
S
I
S
I
сн2
I
-tm-сн—со-
Цистин
0
II
ис-«он,
Гидролиз 5,7 1 НС1
ОН
I
o=s=o
I
сн2
I
Шг-СН—C00H
Цистеиновая кислота (CysSOgH)
Поскольку определение последней не позволяет судить о содержании раздельно остатков цистина и цистеина, данные аминокислотного анализа выражают в остатках "полуцистина". Окисление надмуравьиной кислотой превращает также остатки метионина в метионинсуль-фон, не разрушающийся при гидролизе в отличие от метионина:
63
сн2
сн2
исо-оон
сн2
сн2
—NH—СН—СО-
Метионин
-NH—СН—СО~
Метионинсульфон
(MetS02)
Для количественного определения аминокислот в кислотном гидролизате белка или пептида используют автоматические анализаторы, впервые описанные У .'Стейном, С.Муром и Д.Спекмэном. Их конструкции весьма разнообразны, однако все они основаны на хроматографическом разделении аминокислот на сульфополистирольных катионитах. Элюция аминокислот происходит в порядке, который определяется, во-первых, их кислотно-основными свойствами (аспарагиновая и глутаминовая кислоты элюируются в числе первых; гистидин, лизин и аргинин — последними); во-вторых, гидрофобными взаимодействиями боковых радикалов с полистирольной матрицей ионита (гидрофильные серин и треонин элюируются рано; глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин — примерно в порядке возрастания гидрофобности).
В злюате автоматически проводится цветная реакция аминокислот с нимидрином (см. гл. 1), на которой и основано их количественное определение. Такой способ позволяет определять до 1—10 пмоль аминокислоты. Более чувствительно измерение флуоресценции продукта реакции аминокислот с о-фталевым альдегидом (см. гл. 1), позволяющим определять менее 1 пмоль.
Развивается новый подход к определению аминокислотного состава, при котором аминокислоты превращают в производные, интенсивно поглощающие свет в ультрафиолетовой или видимой области снркт-ра, например в фенилтиокарбамил- (см. гл. 1) или р-диметиламино-фенилазофенилсульфонил (идабсил")-производные:
СН3
Дабсил-аланин
Эти производные разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонках, содержащих С^-производные кремнезема, и определяют содержание аминокислот спектрофотометрически. Метод обладает высокой чувствительностью и скоростью, позволяя определять доли пикомоль — фемтомоли аминокислот.
Оценивая результаты аминокислотного анализа белков и пепгадов, необходимо учитывать ограничения, связанные прежде всего с относительной неточностью ("грубостью") кислотного гидролиза белков. К сожалению, надежный метод полного ферментативного гидролиза белков, который был бы лишен этого недостатка, до сих пор не разработан. Точность самого метода определения аминокислот, как правило, заметно выше — порядка 2—3%. Учитывая это, следует с .осторожностью относиться, например, к данным о небольших (в 1—2 остатка) различиях в составе белков, поскольку они не выходят за пределы возможных погрешностей метода, особенно если речь идет о "трудных" для определения аминокислотах, разрушающихся при гидролизе, образующих трудно расщепляемые пептидные связи или. дающих низкий выход окраски при реакции с нингидрином (например, про-лин).
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed