Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
Метод ограничивают побочные реакции, например образование пироглутаминовой кислоты из N-концевого глутамина, о—/9-перегруп-пировка остатков аспарагиновой кислоты и в особенности неспецифическое расщепление пептидных связей при кислотной обработке. Неполное протекание реакции с фенилизотиоцианатом или циклизации влечет за собой постепенное "отставание" части пептидных цепей от общего хода отщепления аминокислот, вследствие чего на каждом шаге в анализируемой смеси появляются наряду с фенилтиогиданто-ином соответствующей аминокислоты более или менее значительные примеси фенилтиогидантоинов от предыдущих Циклов отщепления.
77
Ввиду этого при анализе протяженных последовательностей чрезвычайно важно, чтобы каждый цикл протекал с выходом, близким количественному. Существенным ограничением являются потери остаточной* белка или пептида, в особенности короткого за счет его растворения в используемых реагентах. Радикальный способ борьбы с такими потерями состоит в ковалентном присоединении к инертной матрице, например к макропористому стеклу, содержащему аминные группы. К такому носителю удается присоединить пептиды, полученные при расщеплении бромцианом за счет реакции лактона гомосери на с аминогруппами:
+ NH2-CH2-CH2-. стекло —>
Аминогруппы, ковалентно присоединенные к стеклу'
сн2-он
| Остаток гомосерина Rn-i СН2
I
—> ~NH-СН—СО-NH-СН-СО—NH—СН2СН2—... стекло Пептид, ковалентно присоединенный к макропористому стеклу
Пептиды, содержащие остатки лизина, присоединяют к аминогруппам на поверхности стекла при помощи реакции с бифункциональным сшивающим реагентом, например р-фенилёндиизоцианатом:
Rn-i СН2 О
I II
-NH-CH-CO-NH-C Н-----С=0
С-Концевой лактон гомосерина
+ S=C=N-C6H5-fl=C=S + NH2CH2CH2—... стекло
nh2
I
Rl (CH2)4 Rn
I I I
NH2-CH-C0-.. ,-NH-C н-CO-. ,-NH-CH-COOH —»
78
N-Концевой
остаток
S
S
II
II
i
!|
NH—С—NH—С 5H5—NH—С-NH~СНг-CH2““... стекло
(СН2)4
-» NH—СИ—со—.. —NH—СИ—CO.. -NH—СИ—СООН
I
Пептид, ковалентно присоединенный к стеклу
c=s
NH—С 6Н 4—NH-CS—NH—СН2СН2—... стекло
Этот реагент образует мостики между носителем и остатками лизина в пептиде, но одновременно блокирует и о-аминогруппу первого аминокислотного остатка. Однако после кислотной обработки N-конце-вой остаток отщепляется от пептида, хотя и остается связанным со стеклом. При этом открывается аминогруппа второго аминокислотного остатка и становится возможным ступенчатое отщепление последующих аминокислот, хотя остатки лизина, прочно связанные с носителем, ускользают от анализа и "пропускаются". Идентификацию первого аминокислотного остатка проводят в' отдельном опыте дансильным методом. Такие "твердофазные" секвенаторы применяют при анализе пептидов и небольших белков.
В еще одном типе секвенаторов — газофазном — принципиально те же реакции проводят с белком, сорбированным на пористой подложке, обрабатывая его парами реагентов и прибегая к жидкостной экстракции лишь для отделения фенилтиазолинонов. Это еще более снижает потери образца и дает возможность определять весьма протяженные последовательности, используя сотни пикомоль белков и крупных пептидов. Удается даже определять N-концевые последовательности в тех небольших количествах белков, которые содержатся в зонах, вырезанных из геля после электрофоретического разделения.
Методом Эдмана установлено подавляющее большинство последовательностей аминокислот при анализе первичной структуры белков.
Вторичной структурой называют пространственное расположение атомов главной цепи молекулы белка на отдельных ее участках.
В соответствии с этим определением любой участок белка имеет вторичную структуру. Иногда рассматривают как вторичную структу-
ГЛАВА 5 ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА
79
ру только те ее элементы, которые являются периодическими-, ot-cnu-ралъ и ^-структуру. Однако в белках нередко встречаются такие участки пептидной цепи, которые уложены вполне определенным способом, хотя их пространственная структура не содержит какого-либо периодически повторяющегося, регулярного мотива. Тем не менее к ним вполне приложимо понятие вторичной структуры. Следует различать два вида вторичных структур: регулярные и нерегулярные.
Понятие вторичной структуры, как подчеркивается в его определении, относится не ко всей белковой молекуле в целом, а к отдельным, более или менее протяженным участкам ее полипептидной цепи. Обсуждая вторичную структуру, мы, по крайней мере на первых порах, абстрагируемся от дальних взаимодействий в молекуле белка, а также от вклада боковых групп аминокислотных остатков, концентрируясь на главной цепи белка. Ближние взаимодействия, которым принадлежит важнейшая роль в формировании вторичной структуры, определяются прежде всего особенностями пептидной связи.
