Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Степанов В.М. -> "Молекулярная биология. Структура и функция белков" -> 31

Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.

Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков — М.: Высшая школа, 1996. — 335 c.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка): strukturifunkciibelkov1996.djvu
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 140 >> Следующая

Метод почти полностью вытеснен так называемым дансилъным методом. В этом случае в качестве реагента на аминогруппу используют 5-диметиламинонафталин-1-сульфохлорид (дансилхлорид) (см. гл.
1). Кислотный гидролиз полученного дансилпептида дает дансил-производное N-концевой аминокислоты, которое идентифицируют двумерной хроматографией на полиамидных пленках. Анализ облегчается интенсивной флуоресценцией дансил-производных в ультрафиолетовом свете, что обеспечивает высокую чувствительность метода, позволяющего работать с количествами пептида порядка нескольких наномоль.
Наиболее продуктивно определение N-концевой последовательности в пептидах и белках фенилтиогидантоиновым методом ступенчатою отщепления аминокислотных остатков, предложенным П:Эдманом. Метод основан на следующей цепи реакций.
Обрабатывая пептид в щелочной среде фенилизотиоцианатом, его превращают в фенилтиокарбамилгпроиэводное:
El Ег Еп
I I
C6H5-N=C=S + nh2-ch-co-nh-ch-co-...-nh-ch-cooh —*
Фенилиэо-
тиоцианат
Ri R2 Rn
—> С6Н5—NH—C~NH—С Н—C0~NH—С Н~СО..N1HC Н~C00H С*АС°в.И_,
II
S
. >
Фенилтиокарбамилпептид
Смысл этой операции состоит во введении нуклеофильного атома серы в положение, благоприятствующее реакции с углеродом карбонильной группы N-концевого остатка, которая происходит на следующей стадии при обработке фенилтиокарбамил-производного три-фторуксусной кислотой:
75
cv гппн + /NH CH R2 Rn
VMM-, CA-NHrfT | | |
^s—c—NH-CH-CO-.. .-M-CH-COOH
I
OH
Промежуточный продукт
| R-2 B-n
¦^N-CH I I
едгммг | + nh2-ch-co-. . .-nh-ch-cooh
^s-c^
Фенилтиазолинон Пептид, укороченный на один
аминокислотный остаток
Ri
/NH-CH
| Фенилтиогидантоин ^NH—C=fl
Результатом этой атаки является образование гипотетического промежуточного продукта, в котором атом углерода карбонила N-koh-цевого остатка приобрел тетраэдрическую конфигурацию. Далее происходит разрыв связи С-N в этом соединении, причем образуются циклический фенилтиазолинон (производное аминоконцевого остатка) и пептид, укороченный на'одну аминокислоту.
Фенилтиазолиноны недостаточно устойчивы, поэтому их подвергают, предварительно отделив от остаточного пептида, более жесткой кислотной обработке при нагревании и переводят в стабильные фенил-тиогидантоины. Последние идентифицируют тонкослойной хроматографией на полиамидных пленках, газожидкостной или высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Образовавшийся после отщепления N-концевого остатка остаточный
1
пептид вновь обрабатывают фенилизотиоцианатом и подвергают далее такому же циклу превращений, отщепляя на этом Шаге вторую аминокислоту, считая с аминного конца. Повторение циклов приводит к ступенчатому отщеплению последующих аминокислотных остатков.
76
Используется также вариант метода Эдмана, при котором идентифицируют не фенилтиосидантоин или другое производное аминокислоты, отщепленной в данном цикле, а следующий за ней остаток, прибегая для этого к определению N-концевой аминокислоты в небольшой доле (аликвоте) остаточного пептида методом дансилирования. Остальную, главную, часть остаточного пептида вводят в новый цикл деградации по Эдману, затем вновь определяют N-концевую аминокислоту в остаточном пептиде, укороченном уже на два остатка, и т.д. Такой способ позволяет обычно определить последовательность 10—15 аминокислот.
Гораздо большие возможности открыла автоматизация' метода Эдмана: разработаны специальные приборы — автоматические секве-наторы белков и пептидов, основанные на его использовании. В одном из видов секвенатора пленку белка или пептида наносят на внутреннюю стенку быстро вращающегося стеклянного стаканчика, который затем используется как реактор. В него последовательно вводят фе-нилизотиоцианат, гептафтормасляную кислоту (высококипящий аналог трифторуксусной кислоты) и проводят циклизацию. Затем внутрь стаканчика подают ток 1-хлорбутана, который, распределяясь под действием центробежной силы по его внутренней стенке, экстрагирует отщепившийся фенилтиазолинон. Экстракт отводят из стаканчика и в отдельной операции превращают фенилтиазолин в фенилтиогиданто-ин. Укороченный белок или пептид остается в виде пленки на стенке стаканчика и далее подвергается следующему циклу отщепления по Эдману и т.д.
Все операции, включая подачу реагентов ц промывание осадка белка или пептида, программированы. Прибор позволяет за сутки проделать 1.5 циклов отщепления. Выход. фенилтиазолинона на цикле обычно близок к 95—99%, что позволяет определить за один опыт последовательность в 20—50, а иногда и больше аминокислотных остатков, используя весьма малые, порядка сотен наномоль, количества белка или пептида.
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed