Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Степанов В.М. -> "Молекулярная биология. Структура и функция белков" -> 25

Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.

Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков — М.: Высшая школа, 1996. — 335 c.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка): strukturifunkciibelkov1996.djvu
Предыдущая << 1 .. 19 20 21 22 23 24 < 25 > 26 27 28 29 30 31 .. 140 >> Следующая

60
нации, без выявления которых исследование структуры белка нельзя считан» завершенным. Ввиду этого методы определения первичной структуры, основанные на анализе самого белка, сохраняют свое значение я продолжают совершенствоваться. Помимо полного анализа первичной структуры те же методы применяют (обычно в неполном объеме) для первичной характеристики вновь выделяемых'белков; сравнения белков между собой, анализа их функционально важных фрагментов, локализации групп, подвергшихся химическому модифицированию, и т.п.
' Число установленных первичных структур быстро нарастает — еще в 1905 г. их счет шел на единицы, в 1975 г. было известно около 600, в 1984 г. — 2600 последовательностей, содержащих около 0,5 млн. аминокислотных остатков, к концу 1980 г. эти цифры возросли соответственно до 14 400 и 4 млн.
4.2. ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИНДИВИДУАЛЬНОСТИ БЕЛКА.
МИКРОГЕТЕРОГЕННОСТЬ БЕЛКОВ
| Определению первичной структуры белка предшествуют его очистка* (см. гл. 3) и установление химической индивидуальности, или, как принято говорить, гомогенности. Универсальных критериев гомогенности белка нет, наиболее строгим доказательством его индивидуальности являете^ однозначное установление первичной структуры, требующее большого труда и временя и не всегда доступное. Практически полезными, хотя и неполными, критериями индивидуальности белка служат:
ялтг обнаружение при диск-электрофорезе или изоэлектрофокусировании единственной белковой полосы, проявляющей характерную для данного белка активность; весьма доказательны данные иммуно-эдентрофореза и иммуноблоттинга;
.г— обнаружение при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии анионного детергента (додецилсульфата натрия); единственной полосы, отвечающей, денатурированному белку, в особенности если- иммуноблоттинг подтверждает, что она несет антигенные детерминанты данного белка. В случае олигомерных белков, построенных из -разных субъединиц, таких полос может быть несколько, однако анализу первичной структуры должно предшествовать разделение субъединиц;
— обнаружение единственного белкового пика, достаточно симметричного и совпадающего с пиком активности при различных методах жидкостной хроматографии (аффинной, ионообменной, гидрофобной, гель-хроматографии). Существенно, чтобы соотношение активности и
61
содержания белка (удельная активность) оставалось постоянным по всеми пику;
— выявление единственной аминоконцевой последовательности. К идентификации аминоконцевого, остатку для этой цели прибегают редко, так как расход белка для получения столь ограниченной < информации оказывается неоправданно большим. • .
Эти приемы не единственны и не обязательны, доказательство индивидуальности строится по-новому для каждого бел$а. Нередко при этом обнаруживается так называемая микрцгетерогенпостъ берка, вызываемая, как правило, неоднозначностью посттранбляционных модификаций или случайными повреждениями белковых молекул in vivo или в процессе выделения. Возможна, впрочем, и гетерогенность, обусловленная функционированием аллельных генов, или альтернативным сплайсингом.i
Среди наиболее частых причин микрогетерогенности укажем внутренние разрывы полипептидной цепи за счет случайного -действия протеиназ, так называемые растрепанные концы (результат неоднозначного процессинга аминоконцевого участка белка), а также дезамьг-дирование отдельных остатков аспарагина, реже глутамина. Последнее может происходить спонтанно, в особенности легко — в последовательности Asn—Gly л приводит к так называемой микрогетерогенности по заряду. Известна микрогетерогенность за счет неполноты фосфорили-рования белка протеинкиназами или различий в структуре углеводных цепей гликопротеинов.
Высказываемые иногда предположения о микрогетерогенности, обусловленной существованием стабильных конформеров белка с одинаковой первичной структурой, экспериментального подтверждения' не получили и труднообъяснимы теоретически. Многие виды микрогете-рогенностй не препятствуют определению аминокислотной последовательности, однако осложняют анализ и должны учитываться при его проведении.
4.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКА
[
• *
Определение аминокислотного состава необходимо для характеристики исследуемого белка, а также пептидных фрагментов, получаемых в ходе анализа первичной структуры. Для расщепления до свободных аминокислот пептид или белок подвергают исчерпывающему гидролизу, нагревая его с постоянной кипящей (5,7 М) НС1 при. 105 ?С в течение 24 ч. Поскольку в таких условиях пептидные связи остатков изолейцина и валина гидролизуются неполно, .проводят также 48- и 72-часовой гидролиз. В то же время серин и треонин недостаточно
62
устойчивы и заметно (примерно на 10%) расщепляются уже за 24 ч. Ввиду этого для получения более надежных величин содержание валина и изолейцина оценивают, экстраполируя найденные значения к п бесконечному" времени, а сб^ержание серина и треонина определяют экстраполяцией к "нулевому" времени гидролиза.
Предыдущая << 1 .. 19 20 21 22 23 24 < 25 > 26 27 28 29 30 31 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed