Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
Еще эффективнее сорбенты, содержащие такие лиганды, который взаимодействуют .не только с зоной связывания, но и с каталитиче-
* У’
ским центром фермента. Например, производные бензиляптарЬой кислоты оказались хорошими лигандами для выделения карбоксипеп-тидаз — ферментов, отщепляющих аминокислоты от карбоксильного конца пептидной цепи. Сходство лиганда с субстратами карбоксипеп-тидаз на первый взгляд невелико, однако оказывается, что группа
54
НООС—СНг способна выступать в качеств© своеобразного аналога пептидной связи:
НС^
НС
сн
I
сн
^сн^
I
сн2
I
-со-NH—СН—C00H
C-Концевой остаток фенилаланина в пептидном субстрате карбоксипептидазы
Аминогруппа, используемая для присоединения лиганда к матрице
\ NH
I
КС
^\си
II
ЯСч. сн
Чл/
I
I
р
но-со-сн2*
сн:
-ен-
от
-C000H
Бензил янтарная кислота, имитирующая структуру остатка фенилаланина; группу СО-NH заменяет С0~СН2
В результате Д-карбоксильная группа бензилянтарной кислоты взаимодействует с каталитическим центром фермента, а боковая бен-зильная группа и а-карбоксил — с компонентами зоны связывания субстрата. Образующийся комплекс лиганда, обычно присоединяемого к матрице через аминогруппу, введенную в парачголоэ&ение бензольного кольца, связывает фермент весьма прочно.
Широко используют своеобразный вариант аффинной хроматографии^ основанный на применении в качестве лигандов синтетических красителей антрахиноповою ряда, например цибакрона голубого;
О nh2
55
Плоская структура, образованная тремя конденсированными ароматическими кольцами замещенного антрахинона, к которому в положении 1 присоединены замещенный анилин и триазиновый цикл, «19С06-на избирательно взаимодействовать с целым рядом белков. Лиганд связывается, по-видимому, во впадинах, которые нередки на поверхности белков, в особенности в активных центрах ферментов. Высказывались предположения, что антрахиноны вместе с присоединенными ядрами анилина и триазина образуют структуру, стерически близкую природным лигандам, например таким коферментам, как NAD, и имитируют свойственный последним способ связывания с белками. Ввиду этого сорбенты, содержащие цибакрон голубой и некоторые другие антрахиноновые красители, особенно рекомендуются для аффинной хроматографии белков, содержащих NAD или иные соединения нуклеотидной природы.
Нет необходимости, чтобы нуклеотид или сходное по строению соединение было похоже на субстрат — оно. может имитировать эффектор, регулирующий активность фермента. Так, например, хорошие результаты дает хроматография на антрахиноновых красителях аспар-таткарбамилазы, где нуклеотиды выступают как аллостерические эффекторы.
Впрочем, круг белков, связываемых этими сорбентами, значительно шире и включает, например, сывороточный альбумин. Последней легк9 присоединяет различные лиганды, в том числе некоторые лекарственные препараты и триптофан, который можно ( с большими оговорками) считать напоминающим конденсированные кольца антрахинона. Структура лиганда — замещенного антрахинона — не безразлич-на, поэтому, используя разные красители, удается получить серило сорбентов, не одинаково связывающих различные белки. л,
3.7. ИММУНОСОРБЦИЯ . J/(Cf
1 'M-v
К числу наиболее специфических принадлежит взаимодействие белков с антителами — иммуноглобулинами. Это свойство с успехом используют для создания биоспецифических сорбентов, в которых роль лиганда выполняют специфические в отношении выделяемого белка иммуноглобулины. Получение и применение такого рода сорбентов происходят примерно так же, как и в обычной аффинной хроодго-графии, отличаясь лишь немногими особенностями. Во-первых, ,присоединение иммуноглобулина G к матрице необходимо проводить в щадящих условиях. Установление между молекулой антитела и носителем множества ковалентных связей (которое может произойти, если добиваться повышения емкости сорбента) благоприятствует денатура-