Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Степанов В.М. -> "Молекулярная биология. Структура и функция белков" -> 30

Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.

Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков — М.: Высшая школа, 1996. — 335 c.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка): strukturifunkciibelkov1996.djvu
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 140 >> Следующая

Хорошие результаты дает также ионообменная хроматография на мелкозернистых ионитах типа Моно-Q и Moho-S (см. гл. 3) с использованием давления порядка 20 атм. Эти методы, обладающие высокой разрешающей способностью, позволили резко сократить число стадий выделения индивидуальных пептидов, снизить их потери и перейти к анализу первичной структуры очень малых (порядка сотен наномоль) количеств белка.
72
4.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ПЕПТИДОВ
4.5.1. Определение С-концевых аминокислот
Определение С-концевых аминокислот и последовательностей пептидов разработано недостаточно. Единственным химическим методом идентификации С-концевых аминокислот, получившим распространение, является исчерпывающий гидраэинолиэ пептидных связей. При нагревании совершенно сухого препарата белка или пептида с безводным гидразином все пептидные связи расщепляются им с образованием соответствующих гидраэидов аминокислот:
Ri Иг Rn-i В-п
II II
-NH-CH-CO-NH-CH—СО—NH-CH-C0-NH-CH-C00H
+ NH2-NH2
I
Ei В.2 Rn-i К
I I I I
NH2-CH-C0-NH-NH2 NH2-CH-C0-NH-NH2 NH2-CH-C0-NH-fffl2 nh2-ch-cooh о^Гидразиды всех аминокислот пептидной цепи С-Концевая
аминокислота
Последние, будучи основаниями (кроме о-гидразидов дикарбоно-вых аминокислот), легко отделяются (например, ионообменной хроматографией в условиях обычного аминокислотного анализа) от единственной свободной аминокислоты, содержащейся в продуктах гидрази-нолиза, которая и является С-концевым остатком.
Ферментативный метод, позволяющий не только идентифицировать С-концевой остаток, но и определить С-концевую последовательность небольшой длины, основан на последовательном отщеплении аминокислот от карбоксильного конца пептида (или белка) при действии карбоксипептидаз.
Карбоксипептидаза А. Фермент поджелудочной железы животных, содержащий ион цинка в активном центре. Активен в слабощелочной или нейтральной среде. Являясь экзопептидазой, фермент отщепляет от карбоксильного конца полипептидной цепи нейтральные и особенно легко гидрофобные аминокислоты. Труднее отщепляются остатки дикарбоновых аминокислот, еще труднее глицин и остатки, за которыми следует пролин. Не отщепляются вовсе пролин и остатки аргинина и лизина.
73
* Карбокснпептндаза В. Также содержится в поджелудочной железе и гомологична карбоксипептидазе А, от которой отличается главным образом специфичностью, отщепляя С-концевые остатки аргинина и лизина.
Карбоксипептвдаза Y (от англ. yeasts — дрожжи). Содержится в клетках дрожжей. Имеет остаток серина в активном центре и обладает весьма широкой специфичностью, отщепляя почти любые аминокислотные остатки (в том числе и остатки пролина) от карбоксильного конца полипептидной цепи. Аналогичные ферменты выделены из грибов и растений.
При действии карбоксипептидаз на пептидный или белковый субстрат после отщепления С-концевого остатка хотя бы от части молекул открывается возможность высвобождения из цепи следующего остатка, затем третьего с С-конца и т.д. Ввиду этого для определения С-конце-вой последовательности необходимо количественно определить накопление аминокислот в зависимости от времени реакции. Анализ данных дополнительно осложняется весьма значительными различиями в скорости отщепления аминокислот, отражающими специфичность фермента. Так, гидрофобные аминокислоты настолько легко отщепляются карбоксипептидазой А, что их количество нередко оказывается почти таким же, как и содержание ранее отщепившихся гидрофильных остатков, пептидные связи которых гидролизуются гораздо медленнее. Скорость гидролиза зависит и от природы аминокислот, предшествующих отщепляемому остатку Pj остатков — Pi, Р2 и т.д.
Таким образом, метод обычно дает возможность определить чередование лишь немногих, обычно 2—5, аминокислотных остатков на карбоксильном участке пептида.
4.5.2. Определение N-концевых аминокислот и последовательностей
Методы анализа пептидов с аминного конца разработаны значительно лучше, чем с карбоксильного, и являются основными при определении первичной структуры белков.
Идентификация N-концевой аминокислоты важна как одно из доказательств индивидуальности пептида или белка. Классическим является применение для этой цели реакции динитрофенилирования. Ди-нитрофторбензол реагирует с о-аминогруппой белка или пептида с образованием окрашенного в желтый цвет (Ащах * 350*360 нм, молярная экстинкция около 15 ООО) 2,4-динитрофенил (Впр)-производного (см. гл. 1). Одновременно в реакцию вступают и е-амицогруппы остат-74
ков лизина, и гидроксильные группы тирозина. Затем динитрофенил-производное гидролизуют 5,7 Н НС1 при 105° С, причем расщепляются все пептидные связи, но сохраняются Dnp-аминокислоты (кроме производных глицина и пролина). Их выделяют из гидролизата и идентифицируют.
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed