Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Степанов В.М. -> "Молекулярная биология. Структура и функция белков" -> 19

Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.

Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков — М.: Высшая школа, 1996. — 335 c.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка): strukturifunkciibelkov1996.djvu
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 140 >> Следующая

Помимо карбоксильных катионитов, о которых шла речь выше, применяют катиониты, содержащие сульфогруппы -S0~, например
сульфопропилсефадекс. В отличие от карбоксильных сульфогруппы сохраняют отрицательный заряд практически при всех pH, используемых в хроматографии белков.
Ионогенные группы фосфоцеллюлоэы слабее, чем у сульфопропил-сефадекса, но сильнее карбоксильных. Оказалось, что этот ионооб-менник может применяться в качестве биоспецифического сорбента при выделении некоторых ферментов фосфорного обмена.
Среди анионитов наибольшее распространение получили диэтил-амипоэтил (DEAEj-^еллюлоза и ее аналоги с иными матрицами;
СН2-СН3
'аннш2-€н2-гГ чсн2-сн3
Диэтиламиноэтильная группа, присоединенная к целлюлозе или другой
полисахаридной матрице
н
Основность диэтиламиноэтильной группы в сорбентах этого типа^ несколько ниже обычной из-за влияния окружающих ее гидроксильных групп, так что ее рКа равен 9,5. DEAE-целлюлоза эффективна как анионообменник вплоть до pH 8,5 — 9,0. Аниониты, содержащие чет^ вертичные аммонийные группы, — QAE-сефадекс или QAE-сефароза , сохраняют положительный заряд и при более высоких pH.
Хроматография белков на DEAE-целлюлозе и аналогичных анионитах, подобно хроматографии на катионитах, определяется многоточечным связыванием отрицательно заряженных групп белка (прежде всего карбоксильных) с катионными группами ионообменника. Как и при хроматографии на катионитах, десорбции белков достигают повышением ионной силы элюирующего раствора, ее можно проводить ступенчато или с применением градиента концентрации соли. И в этом слу-
48
чае не. рекомендуют градиенты pH и использование растворов, содержащих разные анионы. Например, при десорбции белков хлористым натрием с DEAE-целлюлозы, уравновешенной ацетатным буфером, помимо экранирования разноименно заряженных групп сорбента и белка происходит замещение удерживаемых анионитом ацетат-ионов ионами хлора. Если элюция проводится в слабокислых растворах, десорбированные ацетат-ионы, связывая протоны, вызовут сдвиг pH в щелочную сторону, что приведет к локальному изменению условий элюции и сделает процесс трудно контролируемым.
Рис. 3.2. Очистка щелочной фосфатазы ионообменной хроматографией:
1 - оптическая плотность при 280 нм, отражающая общее содержание белка; 2 - активность щелочной фосфатазы;
А - разделение неочищенного препарата на анионите Моно-Q при pH 8 в градиенте концентрации NaCl б - 0,35 М (3);
Б - зфоматофокусирование на Моно-Р щелочной фосфатазы, очищенной на предыдущей стадии в градиенте pH (4);
В - хроматография фракции, выделенной на Моно-Р, на анионите Моно-Q в градиенте концентрации NaCl (5)
В последнее время в хроматографии белков все шире применяют ионообменники на основе гидрофильных органических полимеров, получаемых в форме шариков строго одинакового диаметра (10 мкм) и обладающих большой рабочей поверхностью. Стандартность гранул таких ионитов снижает размывание хроматографических пиков за счет различий во времени диффузии белковых молекул внутри сорбента — фактор, ограничивающий эффективность обычных ионообменников с
_ Т '
неодинаковыми гранулами. Носители этого типа жестки, что позволяет достигать весьма высоких скоростей протекания растворов через колонку при давлении порядка 20 атм1. Совместное действие этих факторов резко повышает эффективность и скорость хроматографии бел-
1 1 атм = 0,1 МПа.
49
ков на такого рода сорбентах, получившей название быстрой жидкостной хроматографии белков (английское сокращенное обозначение FPLC). В качестве сорбентов используют Моно-Q — сильный анионит с четвертичными аммонийными группами, Moho-S — сильный катионит., содержащий сульфогруппы, или Моно-Р — катионит с фосфатными группами (рис. 3.2 ). >
К сожалению, до сих пор не удалось разработать достаточно эффективный способ препаративного электрофореза белков в гелях, хотя их аналитическое разделение электрофорезом в полиакриламидном геле дает очень хорошие результаты и является ведущим методом в исследовании белковых смесей и индивидуальных белков.
Как известно, поверхность белковой глобулы богата гидрофильными аминокислотами, но в то же время содержит немало (до половины от их общего содержания) гидрофобных остатков, нередко образующих скопления ("гроздья"). Такие гидрофобные зоны, развитые в большей или меньшей степени, представляют характерную особенность структуры каждого белка, на чем и основан метод гидрофобной хроматографии. Соответствующие сорбенты синтезируют, включая ' гидрофобные группировки в гидрофильную матрицу, например в пойерёчно-сщитую агарозу — сефарозу. По такому принципу построены, в частности, октил-и фенил сефароза:
ОМ
При пропускании белкового раствора через фенилсефарозу гидрофобные участки поверхности белков образуют контакты с фенильными
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed