Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
Несмотря на указанные ограничения, гель-хроматогрдфия — удобный способ фракционирования белков. Его применяют и для отделения от белков низкомолекулярных примесей, в том числе солей.
В последнее время наряду с гельобразующими материалами для разделения белков по размерам начали применять макропористые неорганические носители — макропористые стекло и силикагель. Обычно. поверхность этих материалов покрывают гидрофильными органическими веществами, чтобы исключить необратимую сорбцию белков. Жесткость этих материалов позволяет разделять белки if о размеру молекул при повышенных давлениях, что ускоряет процесс и снижает помехи со стороны диффузии.'
3.4. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ
Метод ионообменной хроматографии, основанный на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка, принадлежит к числу наиболее используемых. В хроматографии белков практически не применяют синтетические ионообменные смолы на основе полистирола, весьма популярные в аналитической химии, аминокислот и пептидов. Это объясняется, во-первых, большим содержанием поперечных сшивок, делающих материалы такого рода практически непроницаемыми для белков, во-вторых, сорбцией белков, подчас необратимой, на гидрофобной поверхности полистирола. тч По указанным соображениям для разделения белков используют, ионообменники, в которых матрица ("подложка") отчетливо гидр(и филъна. Особенно распространены ионообменники, получаемые присоединением ионогенных групп к целлюлозе, поперечно-сшитым декстра-г нам (сефадексы). '
Для получения катионитов в качестве ионогенной чаще всего исг пользуют карбоксильную группу, рКа которой, несколько изменяющий^ ся в зависимости от микроокружения, близок к 4 (карбоксиметил (СМ)-производные целлюлозы, сефадекса, содержащие группировки
^СН-0-€Н2С00Н).
46
, Карбоксильные группы таких ионитов отрицательно заряжены при рН.5 и выше и, следовательно, способны связывать белки, которые в этих условиях несут положительный заряд. Связывание белков усилит вается, е<^ш на их поверхности встречаются скопления ("гроздья") кадпонрьщ групд. При. прочих равных условиях с катионитом лучше связываются белки большей молекулярной массы, что объясняется кроперативностью многоточечного взаимодействия обширных участков поверхности такого белка с анионными группами ионообменника. ,
Десорбция белков, связанных катионитом, обычно достигается повышением ионной силы элюирующего раствора, причем взаимодействующие между собой заряженные группы белка и ионита оказываются в окружении противоположно заряженных ионов солей. В результате при определенной концентрации соли, характерной для каждого белка, электростатические взаимодействия между ним и ионитом снимаются и белок элюируется с колонки. Плавное увеличение ионной силы раствора, применение линейного или более сложного градиента концентрации соли вызывает десорбцию сначала наиболее слабо удерживаемых молекул, затем более прочно связанных белков и тд. В препаративных опытах нередко прибегают к ступенчатой элюции, при которой концентрация соли повышается скачками. Это ускоряет разделение и позволяет собрать белок в небольшом объеме, однако легко приводит к образованию одним и тем же белком нескольких ложных пйков.
- При промывании колонки с ионитом раствором соли подходящей концентраций белок десорбируется, иногда образуя довольно длинный '‘хвост", что может ,быть следствием неравномерного распределения ионных групп в сорбенте. Участки с их повышенным содержанием, скопления таких групп прочнее удерживают белок, что и вызывает задержку элюции и образование "хвоста". В такой ситуации скачкообразное повышение ионной силы элюирующего раствора резко улучшает условия десорбции, поэтому часть белка, которая в обычных условиях образовывала бы "хвост", десорбируется скачком, давая ложный пик.
Ввиду этого следует определять белковый состав каждой фракции независимым методом, например электрофорезом в полиакриламидном геле, или подвергать сомнительные пики повторной хроматографии в тех же условиях. Несоблюдение таких предосторожностей нередко приводит к ошибочному обнаружению "множественных форм" беЛков.
1 В принципе для десорбции белков с катионитов можно прибегать и к градиенту pH. Например, понижение pH до 3—4 приводит к протонированию карбоксилатных ионов карбоксиметилцеллюлозы или анало-
47
гичных. ионитов и постепенной десорбции связанных с ними .белков. Можно рассчитывать и на достижение изоэлектрической точки сорбированного белка, что опять-таки вызвало бы его десорбцию. Однако такой прием используют не часто не только из-за опасности /Денатурации белков при понижении pH, но и из-за осложнений, связанных с \ сорбцией ионитом части ионов элюирующего раствора и неопределенностью вызываемых этим локальных изменений pH. По таким же соображениям не рекомендуется использовать в ионообменной хроматографии белков растворы, содержащие несколько разных катионов или анионов.
