Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
? _ Ve - Vo
дост ~ Yt - Vo 1
где Vt — полный объем колонки, за вычетом той его часта, которая приходится на сам гельобразующий полимер.
Каждому белку В' зависимости от размеров его молекулы соответствует свое значение Кдост» на чем и основано разделение при гель-хроматографии. Понятно, что если объем элюции Ve близок к свободному объему Vo, то Кдост стремится к нулю и разделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не произойдет/ Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаем весь объем геля (Ve близок к Vt и КДОст стремится к единице), в геле с данными характеристиками не разделятся. Наилучшее разрешение получается, если Кдост находится в пределах 0,4 — 0,6. Разумеется,' пределы разделения можно расширить, используя для высокомолекулярных белков крупнопористые, а для небольших — мелкопористые гели.
Строго говоря, при гель-хроматографии разделение белков опредё^’ ляется не молекулярной массой, а геометрическими размерами молекулы. Соответственно, молекулы вытянутой формы за счет "кувыркания11 в растворе труднее проникают в гели, чем сферические молекулы такой же молекулярной массы. Этим объясняется ранняя алюцИя денатурированных белков, которые ведут себя как неупорядоченный рыхлый клубок, а не как компактная глобула. v . '•
Простая зависимость между объемом элюции и молекулярной массой белка (справедливая, конечно, только для компактных сферических молекул) и легкость эксперимента сделали гель-хроматографию излюбленным методом определения молекулярной массы белков. Для этой цели колонку, заполненную соответствующим гелем, калибруют Набором белков с известными молекулярными массами, после чего определяют объем элюции изучаемого белка и вычисляют его молеку^-1 лярную массу интерполяцией (рис. 3.1). Точность метода не очень* велика, но вполне достаточна для большинства практически встречающихся задач. ,,,Jf
При использовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающие из-за того, что гельобразующий материал не* вполне инертен, как это предполагает теория метода, и может взаимо^ ' действовать с разделяемыми веществами, что искажает зависимость объема элюции от размера молекулы. Это особенно сказывается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкость4 матрицы геля невелика и в крупномасштабных опытах ее взаимодействие с белком мало отражается на процессе.
44
1.0
'мст
Ofi
оа
as*
*
J---L
__I__1.1 I L.I I П —
10*МО* 10*
Молекулярная масса. Да
—- 1. L 1 “““| 1 1 1 ““‘| - 1 io* То* io7
Малскуляная масса, Да ',
Рис. 3.1. Графики зависимости между молекулярной массой белков и коэффициентом доступности для сефадексов серии G "сверхтонких" (А) и сефарозы 2В, 4В и 6В (/
Ннилучшие результаты достигаются, если Кдост для выделяемого белка лежит в диапазоне 0,4 - 0,6
Связывание белков гельобразующими материалами может быть вызвано ионообменными взаимодействиями, в частности1 содержанием отрицательно заряженных групп в полисахаридных матрицах (сефаро-за, сефадекс), а также в полиакриламидных^ материалах! В последних карбоксильные группы возникают при спонтанном гидролизе амидов, в цолисахаридах же они могут образовываться в результате окисления. Задержка при гель-хроматографии, вызванная ионообменными взаимодействиями с матрицей, особенно характерна для катионных белков, например лизоцима и некоторых субтилизинор. Нередко она весьма значительна и может даже препятствовать отделению солей от белка. В аналитических опытах такое удерживание удается подавить значительным повышением ионной силы раствора.
Еще одна причина аномального удерживания веществ при гель-хроматографии, особенно заметная при выделении небольших молекул, например пептидов, -- гидрофобное связывание с матрицей геля. Гидрофобные, элементы включаются в гидрофильные полисахаридные матрицы при обработке их сшивающими агентами, в частности' эпи-хлоргидрином, при синтезе сефадеКса. Пептиды, содержащие гидрофобные, в особенности ароматические, остатки (фенилаланина, триптофана) иногда удерживаются матрицей столь значительно, что появляются в элюате позже неорганических солей.
Разрешающая способность метода не очень велика, в то же время простота проведения и мягкость условий эксперимента являются его бесспорными Преимуществами. Применимость метода на первых этапах очистки ограничивается тем, что для удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого раствора не должен превышать
45
3—5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-хроматоЬрафии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выделения белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частности при обессоливании, объем образца может быть значительно большим, поскольку не требуется высокого разрешения. В таком упрощенном варианте гель-фильтрацию используют особенно часто.
