Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
обеспечивающий конечную концентрацию меченого аденина 10 мкМ при
первоначальной удельной активности (т. е. к 50 мкл реакционной смеси
нужно прибавить 2,35 мкл аденина с удельной активностью 235 мКи/мМ в
концентрации 50 мкКи/мл).
2.3. Реакция
2.3.1. Контроль
Микрометод обладает исключительной чувствительностью: он позволяет
измерять активность ГФРТ до 0,1 пмоль/ч. Все исходные растворы должны
быть стерильны, при всех манипуляциях следует стремиться к идеальной
чистоте. Старайтесь почти не прикасаться пальцами к пробиркам и
микрочашкам (но в перчатках работать неудобно).
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ н ФГК
193
Чтобы добиться максимальной чувствительности, реакционную смесь
приходится инкубировать при 37 °С в течение многих часов или даже
оставлять на всю ночь. Необходимо исключить риск бактериального или иного
загрязнения и быть уверенным в том, что активность каждого фермента с
течением времени будет оставаться линейной. Для того чтобы проследить эту
линейность во времени, нужны предварительные эксперименты, в которых
решается еще одна задача - определение точки, после которой реакция
пойдет на спад (графически это выражается выходом кривой активности на
плато). Без контрольных экспериментов полученные отношения ГФРТ: АФРТ
могут оказаться артефактом.
Очень важную роль в реакции играет ФРПФ. Чтобы добиться максимальной
точности измерений, рекомендуется попробовать разные концентрации этого
соединения. Отсутствие ФРПФ в реакционной смеси предотвращает появление
радиоактивности в осадке хлорида лантана. В эксперименте, предполагающем
анализ целого ряда экстрактов, образцы по очереди вносятся в заранее
приготовленные аликвоты (по 50 мкл) реакционной смеси, при этом следует
отмечать время внесения. Следует включить в качестве "пустых" контролей
поддерживающую среду (РВ1. ПВП) без экстракта в начале и конце загрузки
образцов. Если измерения, относящиеся к продукту в экспериментальных
реакциях, даже незначительно превышают уровни "пустых" контролей,
абсолютно необходимо включить в эксперимент повторные "пустые" контроли с
тем, чтобы убедиться в постоянстве их счета. Результат будет зависеть от
воспроизводимости экспериментальной техники запуска и остановки реакции и
от процедуры отмывки (см. ниже).
Рекомендуется также иметь "пустой" контроль среди экспериментальных
образцов для того, чтобы показать независимость счета, полученного для
одного образца, от счета предыдущего (т. е. "перекрывание") при
последовательной фильтрации и отмывке образцов. В идеальном случае этот
"пустой" контроль должен быть включен после образца, с которым связано
ожидание высокого значения счета продукта.
2.3.2. Постановке эксперимента
1. Составьте протокол опыта: например, "пустые" контроли РВ1.ПВП), 1-3,
образцы (допустим, их 20), 4-23; контроль "перекрывания" (только 50 мкл
реакционной смеси), 24; "пустые" контроли (РВ1.ПВП), 25-27.
2. Приготовьте реакционную смесь. В нашем примере (см. п. 1), потребуется
27 объемов реакционной смеси, по 50 мкл в каждом. Приготовьте общий объем
реакци-
13-171
194
Глава 7
онной смеси следующим образом: 27X38,75 мкл [3НJ-
гипоксантина (12,9 мкМ) в фосфатном буфере (50 мМ, pH 7,4)...1046,25 мкл.
27x5 мкл хлорида магния (50 мМ)...135 мкл.
27x5 мкл ФРПФ (0,585 мг в 0,15 мл)...135 мкл.
27x2,35 мкл [14CJ-аденина (235 мкК.и/мкМ)...63,45 мкл. Общий объем =
1379,7 мкл.
3. Пронумеруйте реакционные пробирки (пластиковые тест-пробирки, Falcon
2038, 10x75 мм) от 1 до 27 и налейте в каждую из них по 50 мкл
реакционной смеси.
4. В период подготовки эксперимента образцы в микрочашках трижды
проведите через процедуру замораживания - оттаивания и центрифугируйте (в
двух направлениях, если нужно) как предлагается в разд. 2.1.
5. Подготовьте микрочашки к вскрытию, нанеся царапину алмазным ножом.
6. Пустите часы.
7. По очереди вскройте каждую микрочашку и, воспользовавшись пипеткой с
мундштуком, контролирующей тонко оттянутую пастеровскую пипетку,
извлеките надосадоч-ную жидкость (~5 мкл), перенесите в соответствующим
образом пронумерованную реакционную пробирку и ставьте инкубировать при
37 °С. Таким образом один за другим все образцы поместите в водяную баню,
отметив стартовое время для каждой реакционной пробирки.
8. Оставьте при 37 °С на нужное для реакции время.
2.4. Прекращение реакции
Останавливающей смесью служит охлажденный во льду раствор 0,1 М хлорида
лантана (LaCl3-7H20, Sigma), содержащий 1 мМ немеченого гипоксантина
(Sigma) и 1 мМ немеченого аденина (Sigma).
1. В нужное время вынимайте реакционные пробирки одну за другой и
добавляйте в каждую по 1 мл останавливающей смеси и так же по очереди
ставьте в ледяную баню, пока там не окажутся все образцы.
2. Оставьте на 30 мин после остановки последней реакции. Тяжелый металл
лантан вызовет осаждение нуклеотид-монофосфатных продуктов (IMP и АМР).
2.5. Фильтрация и отмывка
Осажденные продукты собирают на стекловолокнистых фильтрах (2,4 см,
