Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 82

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 162 >> Следующая

микроанализа. А. Экстракт постимплантационного эмбриона развели вдвое, по
5 мкл разбавленных образцов добавили к 50-мкл аликвотам реакционной
смеси. Реакции были остановлены через 2 ч нагреванием пробирок в кипящей
водяной бане. В каждую пробирку внесли по 20 мкл дистиллированной воды,
содержащей стандартные растворы гуаиииа, аденина, GMP и АМР (каждый в
концентрации 0,5 мМ); весь объем (по 5 мкл) нанесли на бумагу ТСХ и
высушили. Процедура хроматографии проводилась согласно подписи к рис.
7.3. По окончании разделения отметили положение маркерных оснований и
нуклеотидов и разрезали ТСХ на полоски, соответствующие образцам.
Целлюлозу снимали с учетом положения маркированных дорожек (на рис. 7.3
это 2, 3, 4 и 6), а также с остальной части полоски (1, 5, 7 на рис. 7.3)
и измеряли радиоактивность в сцинтилляциоиной жидкости (толуол : тритон
Х-100: вода, 4:2:1). Конверсия субстратов (гуаиииа и аденина) в продукты
(GMP и АМР) показана в зависимости от количества эмбрионального экстракта
Счет каждой пары субстрат-продукт выражен процентом общего счета в
полоске образца. Б. Для анализа было взято несколько реакционных пробирок
с различным количеством эмбрионального экстракта, дублирующие образцы
использовали для разделения путем ТСХ и лаитановон преципитации.
Измерения радиоактивности продуктов (GMP и АМР), полученных в результате
ТСХ (О), эквивалентны соответствующим значениям для GMP и АМР, осажденных
на стекловолокнистых фильтрах хлоридом лантана (0).
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
201
Глицер
И
гдг
Глицероп-Ф
NAD NADH Дигидроацетон-Ф | ТФИ Г лицеральдегид-ЗФ NAD
фруктозо-1,6-диФ | АЛД
Г лицеральдегид-ЗФ NAD
дигидроксиацетон-Ф ГДГ
}ральдегид*4Ф ¦
* ADP >1
^ (tm) ,-АтЦ
>1 ,-"-NADH"J
1 ГАФДГ / ] ГДГ
d--' nadH
Ртлицерат Глицерол-Ф
NADH'fl 1,3 дифтлицерат
ФГК-1
NADH 1,3 диф-гпицерат ADP
i
ФГК-1
АТР-
ЗФ-глицерат
ЗФ-глицерат Дополнительная система
Д-глюкозэ
^АТР J
I ГК
ADP-
Г люкоза-бФ NADP ¦
NADP-J
NADPH-"i
Г6ФД
бФ-гпюконо-лактон
Рис, 7.5. Обратная [30] и прямая [32] окрашивающие реакции, используемые
для определения активности фосфоглицераткииазы (ФГК), представлены
соответственно в виде схем А и Б. А. Обратная реакция ФГК-1 связана с
превращением флуоресцирующего NADH в иефлуоресцирующий NAD под действием
глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФДГ). Эффективность окрашивающей
реакции можно повысить превращением глицеральде-гцд-3-фосфата до а-
глицеролфосфата триозофосфатизомеразой (ТФИ) и а-гли-дерофосфат-
дегидрогеиазой (ГДГ). Б. 1,3-дифосфоглицерат, нестойкий субстрат ФГК-1,
образуется из фруктозо-1,6-дифосфата с помощью альдолазы (АЛД) и
глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФДГ). АТР, образующийся под
действием ФГК-1, связан с дополнительной ферментной системой гексокиназы
(ГК) и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФД), приводящих к превращению
иефлуоресцирующего NADP в флуоресцирующий NADPH. ГК обеспечивает
восстановление ADP; дигидроксиацетоифосфат и NADH элиминируются а-
глицерофосфат-дегидрогеназой (ГДГ).
Мейра Хан [31] предложила проводить электрофорез нескольких ферментов, в
том числе ФГК-1, на целлюлозно-ацетатных гелях. Бючер [32] применила эту
методику в сочетании с окрашиванием прямой реакции (рис. 7.5, Б) для
получения изозимных полос ФГК-1А и ФГК-1Б в тканевых экстрактах
гетерозиготных мышей.
202
Глава 7
Этот метод имеет ряд преимуществ:
а) лучшее разделение полос;
б) уменьшение времени электрофореза;
в) поступление 1,3-дифосфоглицерата - нестойкого субстрата ФГК-1-в
результате его образования из фруктозо-1,6-дифосфата.
Активность ФГК.-1 может быть продемонстрирована посредством
дополнительной ферментной системы. Гексокиназа использует АТР,
образующуюся в реакции, катализируемой ФГК-1, для фосфорилирования
глюкозы, в результате чего восстанавливается ADP. Образующийся глюкозо-6-
фосфат превращается глюкозо-6-фосфат - дегидрогеназой (G6PD, КФ 1.1.49) в
глюконо-лактон с восстановлением иефлуоресцирующего NADP в
флуоресцирующий NADPH.
Флуоресценция, испускаемая NADPH, может быть измерена фотоумножителем,
который сконструировала Бючер [32]. Гель помещается на движущийся
конвейер (самописец представляет собой вариант сканирующего устройства) и
сканируется УФ-лу-чами с длиной волны 365 нм, сфокусированными на геле
через щель. Фотоумножитель передает флуоресценцию NADPH на усилитель,
соединенный с самописцем, а тот в свою очередь регистрирует пики,
пропорциональные флуоресценции, источником которой является полоса на
геле. Имеющийся в продаже денситометр (Sigma FTP-20, Oriel Sci'entific)
устроен принципиально так же, с его помощью можно сканировать гели как
при просвечивании и отражении, так и при флуоресценции. Схемы этих
оптических устройств показаны на рис. 7.6.
С одной полосы можно получить несколько показаний активности; таким
образом по мере проявления краски на геле области повышающихся пиков
дадут соответствующую кривую. Области под пиками в линейной части кривой,
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed