Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
первичной энтодерме [11-13].
2. В примордиальных половых клетках наблюдается случайная инактивация Х-
хромосомы мыши [14, 15].
3. Изучение мозаиков выявляет корреляции пропорций материнских и
отцовских Х-хромосом, активных в дефинитивных герминативных слоях и в
половых клетках. Следовательно, эти ткани произошли из общего пула клеток
с инактивированной Х-хромосомой [16].
4. Преимущественная экспрессия транслоцированной Х-хромосомы является
следствием селекции клеток в раннем развитии [17].
5. В ооцитах гетерозиготных самок, как правило, экспрессируется аллель
Pgk-Ib [18].
Глава 7
6. Индивидуальные крипты кишечника гетерозиготных самок экспрессируют
либо один, либо другой изозим, что свидетельствует об их моноклональном
происхождении [19].
7. В случае химер по клеткам крови, образованных в результате инъекции
красного костного мозга летально облученным мышам, изозимы ФГК-1
используются для наблюдений над заселением красного костного мозга и
периферической крови [20J.
8. Изозимы ФГК-1 дают ценную информацию прн изучении клональных
взаимодействий в опухолях [21].
2. Двойной микроанализ ГФРТ и АФРТ
ГФРТ - Х-кодируемый фермент [3, 22], который катализирует превращение
гипоксантина и гуаиина в инозинмонофосфат (IMP) и гуанозинмонофосфат
(GMP). АФРТ закодирована в аутосоме [23]; ее роль заключается в
превращении аденина в аденозинмонофосфат (АМР). Оба фермента используют
фос-форибозилпирофосфат (ФРПФ) в качестве источника фосфори-бозилового
остатка. С помощью метода двойного мечения Гар-тлер [24] измерил уровни
ГФРТ и АФРТ в волосяных фолликулах, отделяя субстрат от продукта путем
тонкослойной хроматографии (ТСХ). Другие исследователи разделяли субстрат
и продукт обеих реакций в процессе высоковольтного электрофореза [25].
Применяемый нами метод (он представляет собой видоизменение метода,
предложенного Бакеем [26]) использовали также Мак-Берни и Адамсон [27].
Он заключается в том, что эмбриональные экстракты добавляют в реакционную
смесь, содержащую меченые субстраты, [Н3]-гнпоксантин (или гуанин) и
[С14] -аденин, и ФРПФ. Меченые нуклеотидные продукты- IMP (или GMP) и АМР
- осаждают хлоридом лантана, собирают на стекловолокнистом фильтре и
определяют связавшуюся радиоактивность с помощью сцинтилляциониого
счетчика (рис. 7.1).
Манк и Катуриа [28] разработали методику, оказавшуюся достаточно
чувствительной для измерения активности отдельных предимплантационных
эмбрионов; в течение последующих лет нам удалось увеличить
чувствительность метода, и сейчас мы можем уловить активность менее чем 1
пмоль/ч в одной реакционной смеси. Активность каждого фермента (или
обоих) можно измерять в отдельных клетках или даже в одном бластомере 16-
клеточной стадии. После того как эксперимент отлажен и исследователь
вполне овладел микрометодом, за день можно сделать до 100 определений.
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ н ФГК
189
и считайте
Рис. 7.1. Схема, обобщающая двойной микрометод определения активности
ГФРТ и АФРТ в эмбриональном экстракте. Детали описаны в тексте. На схеме
представлен анализ единственного эмбриона. Эмбрион, помещенный в среду
РВ1.ПВП, переносится в центр мнкрокапсулы, концы которой затем запаивают
и хранят при - 70 СС. Для анализа образец трижды подвергают процедуре
замораживания - оттаивания, затем центрифугируют и супернатант (~5 мкмл)
добавляют к реакционной смеси.
2.1. Приготовление образца
Способы получения яиц и предимплантационных эмбрионов, а также методы
работы с ними описаны в гл. 2 (разд. 2 и 3). Выделение клеточных линий
ВКМ и ТЭ на стадии бластоцисты производят согласно методике, изложенной в
разд. 3.4 и 3.J> гл. 2. Способ получения постимплантационных эмбрионов
описан в разд. 4, гл. 3. Выделение половых клеток может быть осуществлено
следующим образом.
1. Отпрепарируйте гонады у постимплантационных эмбрионов. Промойте их и
инкубируйте в фосфатно-солевом буфере, содержащем вместо альбумина 0,4%-
ный поливи-нилпирролидон (РВ1.ПВП) (гл. 13, разд. 3.1.1) и 0,2%-ный ЭДТА,
при комнатной температуре в течение 30 мин.
2. Освободите половые клетки, разрывая гонады и надавливая на них.
3. Очистите половые клетки от примеси соматических клеток гонады и
эритроцитов, слегка отгоняя их струей среды из пипетки. Старайтесь при
этом половые клетки собрать вместе.
190
Глава 7
4. Перенесите половые клетки в микрочашки (см. ниже) и храните при -70°С.
В ходе всех процедур выделения эмбрионов и промывания клеток или тканей в
качестве среды следует использовать РВ1. ПВП. Смысл включения ПВП в среду
заключается в том, что этот компонент увеличивает ее вязкость и снижает
адгезивность маленьких кусочков ткани или изолированных клеток,
вследствие чего они не пристают к стенкам стеклянных пипеток и
микрочашек, и, следовательно, не теряются. В случае предимплантационных
эмбрионов, окруженных нелипкой блестящей оболочкой, опасность потери не
столь велика. Альбумин не используется по той причине, что он может
