Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 78

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 72 73 74 75 76 77 < 78 > 79 80 81 82 83 84 .. 162 >> Следующая

показать при микроанализе ферментативную активность. Если проблема
адгезивности остается, можно посоветовать держать среду (и часовые
стекла) холодными и до помещения пробы в микрочашки не давать жидкости с
материалом отстояться.
Пробы собирают в микрочашки с 5 мкл РВ1.ПВП после следующих манипуляций.
1. Наберите достаточное количество РВ1.ПВП в тонко оттянутую
пастеровскую пипетку, соединенную резиновой трубкой с мундштуком.
2. В ту же пипетку втяните образец. Образцом может быть
один бластомер, один предимплантационный эмбрион, один
постимплантационный эмбрион (или его часть) или, например, 50 половых
клеток.
3. Введите конец пипетки в микрочашку (Drummond) объ-
емом 10 мкл и выпустите эмбрионы с жидкостью так, чтобы она заняла
половину объема чашки (5 мкл). Наблюдая в микроскоп, убедитесь в том, что
эмбрионы, ткань или клетки попали в чашку.
4. Удерживая микрочашку между большим и указательным пальцами,
столкните образец в середину чашки мягким ударом основания ладони о
поверхность стола.
5. Немедленно закупорьте края микрочашки, оплавив стек-
ло в пламени.
6. Проконтролируйте под микроскопом качество сплавления.
7. Храните образцы в маленьких пластиковых пробирках (Falcon) при -70°С.
8. Перед анализом образцы трижды подвергните процедуре замораживания-
оттаивания, перенося их из -70°Св комнатную температуру и обратно (не
пользуйтесь жидким азотом: микрочашка может лопнуть).
9. Центрифугируйте в контейнерах для пробирок типа Falcon (2000 об/мин
в течение 5 мин при 4°С). (Если
Биохимический микроанализ ферментов ГФРТ и ФГК
191
образцы прилипнут к стенкам, можно отделить их центрифугированием в
другом направлении).
10. Отберите супернатант для анализа.
2.2. Реакционная смесь
Для измерения активности ГФРТ и АФРТ эмбриональный экстракт инкубируют
при 37 °С в 50 мкл реакционной смеси, которая состоит из следующих
компонентов: натрий-фосфатный буфер (38, 75 мМ с pH 7,4), хлорид магния
(5 мМ), ФРПФ (1 мМ), [3HJ-гипоксантин (10 мкМ) и [14С]-аденин (10 мкМ).
(В ранних экспериментах в качестве субстрата для ГФРТ мы использовали
вместо гипоксантина [3Н]-гуанин.) Чтобы чувствительность была
максимальной, следует использовать неразве-денный [иС]-аденин с самой
высокой удельной активностью. Прочие реактивы готовят и хранят в виде
стерильных исходных растворов небольшими объемами, чтобы не открывать
лишний раз пробирку во избежание загрязнений. Приготовление исходных
растворов описано ниже.
2.2.1. Фосфатный буфер и [3Н]-гипонсантин
Приготовьте натрий-фосфатный буфер (50 мМ pH 7,4). Для этого смешайте
1,75 мл 0,2 М NaH2P04-H20; 8,25 мл 0,2 М Na2HP04- 12Н20 и 30 мл воды.
Доведите pH до 7,4. Стерилизуйте фильтрованием. Этим буферным компонентом
реакционной смеси разведите [3Н]-гипоксантин (последний продается в виде
лиофилизированного препарата (TRA.74, 1-10 Ки/мМ,
Amersham) следующим образом.
1. Растворите лиофилизированный препарат в натрий-фос-фатном буфере (50
мМ, pH 7,4) до концентрации 12,9 мкМ. Например, 1 мКи [3Н]-гнпоксантина с
активностью 6,2 Ки/мМ растворяется в 12,5 мл буфера.
2. Осторожно наберите раствор [3Н]-гипоксантина в шприц и распределите
его аликвоты примерно по 2 мл, пропустив через стерилизующий фильтр (Mil
lex, Millipore), по небольшим пробиркам (Falcon). Храните прн 4°С.
3. Если понадобится уменьшить удельную активность, смешайте исходный
радиоактивный гипоксантин с 12,9 мкМ немеченого гипоксантина (Sigma),
растворенного в фосфатном буфере (50 мМ). Немеченый исходный гипоксантин
стерилизуется фильтрованием через миллипоровый фильтр и хранится порциями
по 10 мл в пробирках (Falcon) при 4 °С.
4. Используйте по 38,75 мкл [3Н]-гипоксантина в буфере с первоначальной
удельной активностью (или, если потре-
192
Глава 7
буется, с более низкой удельной активностью) на 50 мкл реакционной смеси
(конечная концентрация гипоксантн-на 10 мкМ и буфера 38,75 мМ).
UJ. Хлорид магния
Приготовьте хлорид магния (MgCl2-6H20) в концентрации 50 мМ и пропустите
через миллипоровый фильтр по 1 мл в стерильные пробирки (Falcon). Храните
при 4°С. Хлорид магния готовится отдельно и добавляется в процессе
составления реакционной смеси (во избежание осаждения при хранении). На
50 мкл реакционной смеси следует брать по 5 мкл хлорида магния (конечная
концентрация 5 мМ).
2.2.3. Фосфорибозиллирофосфат
ФРПФ (м. в. 390,1; Sigma) храните в твердом состоянии при -20°С, его
раствор (10 мМ) готовьте непосредственно перед составлением реакционной
смеси (конечная концентрация 1 мМ). Определите общий объем раствора ФРПФ,
который потребуется, и растворите в концентрации 0,39 мг/0,1 мл в
стерильной дистиллированной воде.
2.2.4. [,4С]-адеиин
[и-14С]-аденин (CFA-436; >220 мКи/мМ, Amersham) продается в виде
жидкости. Храните при 4°С. Используйте однородно меченный аденин,
поскольку среди имеющихся препаратов аденина он.обладает наиболее высокой
удельной активностью. К 50 мкл реакционной смеси следует добавить объем,
Предыдущая << 1 .. 72 73 74 75 76 77 < 78 > 79 80 81 82 83 84 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed