Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
под контролем микроскопа с использованием стеклянных блоков с лунками и
стеклянных пипеток (если нужно, изогнутых). Для заключения в смолу низкой
вязкости (Spurr) следует применять ВЕЕМ-кап-сулы (Polaron Equipment Ltd,
Watford, Herts).
1. Фиксируйте эмбрионы или бластомеры в течение 15- 20 мин при комнатной
температуре в свежеприготовленном 3%-ном растворе глутаральдегида в 0,1 М
какоди-лате натрия (pH 7,3). Дважды промойте в какодилатном буфере.
2. Проведите постфиксацию в 1%-ном OsCL в 0,1 М како-дилате натрия (pH
7,3) в течение 30 мин при комнатной температуре. Поскольку пары
тетроксида осмия очень токсичны, эту манипуляцию с эмбрионами лучше
проводить в маленьких каплях OsCU под маслом в пластиковых чашках Петри
(в вытяжном шкафу).
3. Промойте эмбрионы или бластомеры в бидистиллирован-ной воде, окрасые
их в насыщенном водном растворе уранилацетата в течение 30 мин при
комнатной температуре.
4. Обезводьте проводкой через серию спиртов возрастающей крепости. По
достижении 70% -ного спирта эмбрионы начинают прилипать к стеклянным
поверхностям, поэтому целесообразнее менять спирт, чем переносить
эмбрионы.
5. В качестве заключающей среды наиболее пригодна смола Spurr ввиду ее
низкой вязкости. Поскольку некоторые компоненты смолы лабильны, для
каждой партии сделайте пробную полимеризацию. Приготовьте смолу Spurr
согласно инструкции изготовителя. Храните при -20 °С не более двух
недель, перед использованием дайте нагреться до комнатной температуры.
6. Инкубируйте эмбрионы в смеси Spurr: 100%-ный спирт 1 : 1 (по объему)
1-2 ч при комнатной температуре, затем в смеси, состоящей из тех же
компонентов, но взятых в соотношении 2 : 1 (по объему) 1-2 ч при
комнатной температуре. Чтобы расположить несколько эмбрионов в центре
плоского основания ВЕЕМ-капсулы, воспользуйтесь изогнутой пипеткой,
наполните капсулы Spurr и полимеризуйте при 60 °С 16 ч.
7. Сделайте ультратонкие срезы и поместите их на медную сеточку
(предпочтительнее использовать сетки Gilderg-rids 200 HS).
Эксперименты с предимплаитациоиными эмбрионами мыши___________57
8. Приготовьте красящие растворы:
а) спиртовой уранилацетат: насыщенный раствор в
50%-ном этаноле, храните в темной посуде;
б) цитрат свинца: добавьте 2,33 г нитрата свинца и 1,76 г цитрата натрия
к 30 мл бидистиллированной воды без СОг в 50-мл мерной колбе. Постоянно
встряхивайте в течение 1 мин и время от времени в течение 30 мин.
Прибавьте 8 мл 1 М NaOH (Апа-lar-раствор без хлопьев).
Долейте бидистиллированной воды до 50 мл.
9. Поместите нужное число капель (одна на сеточку) спиртового уранил-
ацетата, профильтрованного через миллипоровый фильтр, на розовый зубной
воск в пластиковой чашке Петри. На каждую каплю положите по одной сеточке
срезами вниз. Закройте крышкой и оставьте на 10-15 мин.
10. Сеточки извлекайте по очереди и смывайте краску стекающими каплями
бидистиллированной воды без СОг. Высушите сеточки на плотной
фильтровальной бумаге.
11. Центрифугируйте раствор цитрата свинца в течение 10 мин при 5000
об/мин. Нанесите капли чистого супернатанта на зубной воск в чашке Петри.
По краю поместите несколько шариков NaOH и на каждую каплю положите по
сеточке срезом вниз. Над каплями не дышите, т. к. СОг вызовет осаждение
свинца. Окрашивайте 5 мин. Смойте краситель бидистиллированной водой без
СОг и высушите.
12. Смотрите в просвечивающем электронном микроскопе.
4.3. Маркеры клеточкой линии
Идеальный маркер клеточной линии должен обладать рядом особенностей:
локализоваться во всех клетках данной линии, сохранять клеточную
автономность, быть стабильным, легко выявляемым и нейтральным. В
последнее время найдено несколько маркеров, удовлетворяющих этим
требованиям [50]. Опишем два приема мечения, которые с успехом
используются при работе с мышью (см. гл. 6). Изолированные бластомеры или
интактные эмбрионы инкубируют в среде с ФИТЦ (0,5 мг/мл) в негазованной
среде Мб, pH 7,7, содержащей 4 мг/мл ПВП, в течение 10 мин при комнатной
температуре, а затем промывают в М2 + БСА и культивируют в М16+БСА [51].
Метящиеся клетки должны находиться в суспензии, иначе они прилипают к
чашке и подвергаются лизису. Важно помнить также, что клетки, выбранные
для мечения, должны быть отделены от соседей, вот почему важно
подвергнуть их диссо-
58
Глава 2
циации. Идеальный маркер - это маркер, который был бы способен пометить
всю клеточную популяцию в интактном эмбрионе без нарушения его
целостности.
Этому требованию, по-видимому, отвечает монодисперсная суспензия
микрочастиц карбоксилированного латекса, покрытых флуоресцеином (желто-
зеленый Fluoresbrite; частицы 0,2 мкм диаметром) [13]. Метка легко
включается в дробящиеся бластомеры путем эндоцитоза, она четко выявляется
на прижизненных и фиксированных препаратах, на срезах и не оказывает
видимого влияния на развитие. Более того, эти частицы могут иметь
различные размеры и могут быть покрыты другими флуорохромами. Существует
