Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 21

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 15 16 17 18 19 20 < 21 > 22 23 24 25 26 27 .. 162 >> Следующая

перед употреблением (по 30 мин в 20-, 40-, 60%-ном спиртах, на ночь в
70%-ном спирте при 4°С, затем по 30 мин в 70-, 90-, 95%-ном и две
экспозиции до высыхания в 100%-ном Analar-этаноле).
5. Высушивание до критической точки, напыление золотом и заключение для
рассматривания - как обычно [42].
54
Глава 2
4.1.3. Замораживание - скалывание
Эта методика, используемая в сочетании с агентами, которые связываются со
специфическими компонентами мембраны и вызывают идентифицируемые
нарушения в мембранных репликах (например, связывающийся со стеролом
антибиотик фи-липин [32J), позволяет изучать топографию мембраны с
разрешением, примерно в 10 раз превышающим разрешение СЭМ [32, 44].
Проводка материала не отличается от обычной [45]. Разница состоит только
в том, что малые размеры эмбрионов вынуждают заключить их в специально
сконструированные держатели [44] или матрикс (например, желатину
[32]). В удалении блестящей оболочки нет необходимости.
4.2. Мечение внутриклеточных компонентов
4.2.1. Иммуноцитохимия на светооптичаском уровне
Мышиными эмбрионами ранних стадий и составляющими их клетками наиболее
легко манипулировать при фиксации и иммуноцитологическом окрашивании в
том случае, когда они прикреплены к покровным стеклам. Методика,
первоначально разработанная для хромосом типа ламповых щеток, была
модифицирована для выявления клеточных, органоидов н цитоскелета [46].
Она предусматривает использование антител к актину [46], тубулину [41],
центрам сборки микротрубочек [47], пластинам ядерного матрикса [48],
клатрину и лизосо-мам [48].
В случае необходимости соотнести внутриклеточную организацию с
поверхностной полярностью, эмбрионы с удаленной блестящей оболочкой или
клетки метят ФИТЦ- или родамин-КонА и затем отмывают (разд. 4.1.1) перед
иммуноцнтологиче-ским окрашиванием.
Для фиксации, экстрагирования и окрашивания эмбрионов или клеток
сконструированы специальные стеклянные камеры, состоящие из стеклянного
промывателя (толщиной 1,5 мм и наружным диаметром 25 мм), к которому
парафиновым воском прикрепляется покровное стекло [46]. Цитохимическая
процедура заключается в следующем.
1. На покровное стекло нанесите при комнатной температуре на 5 мин 0,1
мг/мл КонА или, если клетки уже окрашены КонА для определения
поверхностной полярности,- ФГА в разведении 1:20 (Gibco).
2. Сполосните покровное стекло М2 (см. табл. 2.5)+4 мг/мл
поливинилпирролидона (ПВП) и наполните камеру смесью М2 + ПВП.
Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши___________55
3. Пипеткой нанесите на покровное стекло клетки, они должны сразу прочно
прикрепиться.
4. Закройте камеры другим покровным стеклом и поставьте в 50-мл
поликарбонатную центрифужную пробирку с отверстием в основании и Регрех-
поршнем в нижней трети. В пробирку можно поместить до 4 камер,
перемежающихся 25-мм миллипоровыми префильтрами.
5. Приклейте клетки к покровным стеклам, центрифугируя их при 500g в
течение 10 мин при 20 °С в НВ-4 роторе центрифуги Sorvall RC-5.
6. После центрифугирования через отверстие в основании пробирки введите
стержень и осторожно выталкивайте поршень, пока не появятся камеры,
которые можно извлечь.
7. Снимите верхнее покровное стекло, служащее крышкой. Фиксируйте клетки
3,7%-ным формалином в PBS в течение 35-40 мин при 20°С, промойте 4 раза в
PBS, экстрагируйте 0,25%-ным Тритоном Х-100 в PBS в течение 10 мин при 20
°С и, наконец, дважды промойте в PBS. Эта процедура обеспечивает
наилучшую сохранность клеток и проникновение антител и, кроме того,
сводит до минимума перестройку клеточных белков в процессе
экстрагирования фиксированных клеток [46]. Однако последовательность
фиксации и пермеабилиза-ции нужно устанавливать для каждого детерминанта
отдельно. Например, при окрашивании центра сборки микротрубочек
необходимо сначала провести экстрагирование, а затем фиксацию для
уменьшения цитоплазматического фона [47].
8. Выньте покровные стекла из их камер и перенесите в PBS с 0,1%-ным
твином-20 (PBS-твин) до инкубирования их со специфическим антителом или
другим реагентом.
9. Инкубируйте экстрагированные клетки при комнатной температуре около 30
мин в соответствующем разведении специфических антител в PBS-твине + З
мг/мл БСА, вторыми (мечеными) антителами, разведенными в PBS-дважды
промойте в PBS-твине и окрашивайте 20 мин твине + 3 мг/мл БСА.
10. Снова промойте клетки в PBS-твине, удалите покровные стекла из
камер, заключите в Cittifluor (City University London), снижающий падение
интенсивности метки, и просматривайте в- флуоресцентном микроскопе. При
применении в качестве второго слоя антител, меченных пероксидазой,
пероксидазная активность выявляется ме* тодом Грэма и Карновского [49].
56
Глава 2
4.2.2. Изучение внутриклеточного строения с помощью просвечиввющей
электронной микроскопии
Приготовление препаратов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
- многоэтапный процесс. Все манипуляции в этом случае должны проводиться
Предыдущая << 1 .. 15 16 17 18 19 20 < 21 > 22 23 24 25 26 27 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed