Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 16

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 10 11 12 13 14 15 < 16 > 17 18 19 20 21 22 .. 162 >> Следующая

видны лучше, если блестящая оболочка удалена сразу после оплодотворения.
Удаление оболочки проназой требует большего времени (3-4 минуты), фермент
разбавляется и эффективно ингибируется при переносе эмбрионов в теплую М2
+ БСА.
3. Промойте эмбрионы в культуральной среде Ml6 +БСА (табл. 2.5) и
инкубируйте при 37° в атмосфере с 5% С02 под маслом.
Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши___________43
Следует обратить внимание на два важных обстоятельства. Во-первых,
удаление оболочки может повлиять на компоненты клеточной поверхности и,
возможно, дитоскелета [24J, поэтому необходимо некоторое время на
регенерацию. Во-вторых, эмбрионы, лишенные оболочек, становятся очень
липкими, склеиваются и прилипают к дну культуральных чашек. Их
культивируют по отдельности в маленьких каплях М16 + БСА в специальных
неадгезивных чашках Петри (Sterilin).
3.2.2. Диссоциация клеток
Чтобы диссоциировать эмбрионы на отдельные клетки эффективно и с
наименьшим повреждением клеток, необходимо пользоваться микропипеткой, у
которой конец оплавлен, а внутренний диаметр чуть больше диаметра клеток.
Микропппетки легко изготовить вручную, вытягивая капиллярную трубку 1,2
мм (разд. 5.3.6), хотя можно воспользоваться электродным вытягивателем, а
конец пипетки подвергнуть микроковке. Капиллярные пипетки при помощи
специальных переходников с держателями присоединяют к мундштуку. Для
диссоциации эмбрионов на стадиях раннего дробления (от 2-клеточной до
поздней 8-клеточной) достаточно поместить их в бескальциевую среду,
которая нарушает Са2+-зависимую адгезионную систему
[2J.
1. Инкубируйте эмбрионы (без оболочки) приблизительно 10 мин в
бескальциевой среде М2 + 6 мг/мл БСА (табл.
2.5) под маслом при 37 °С.
2. Небольшие группы эмбрионов (3-4) пипетируйте, втягивая и выталкивая их
через микропипетку, отверстие которой чуть меньше диаметра эмбрионов. Все
манипуляции проводите в культуральных чашках на нагревательном (37°С)
столике препаровального стереомикроскопа. Единичные клетки, отделяющиеся
в процессе этой манипуляции, отбирайте, а оставшиеся клеточные агрегаты и
эмбрионы продолжайте пипетировать до полной диссоциации. В некоторых
случаях отделяются пары клеток, соединенных цитоплазматическим мостиком,
- это результат незавершенного цитокинеза; мостики маркируют место
контакта между клетками и указывают на направление плоскости дробления
[12J.
3. Изолированные клетки промойте в теплых каплях М16 + + БСА (табл. 2.5)
в неадгезивных чашках (Sterilin) и культивируйте их группами или
поодиночке в маленьких каплях. Если клетки культивируются группами, нужно
позаботиться о том, чтобы они не соприкасались (во избежание слипания).
44
Глава 2
Таблица 2.5. Составление культуральной среды (М16, М2)
1. Исходный раствор для приготовления среды М16 и М2
Состав г/100 мл
Исходный раствор А, 10 X NaCI 5,534
(десятикратный) КС1 0,360
КН2Р04 0,162
MgS04-7H20 0,294
Лактат натрия 60%-ный сироп 2,608(3,2 мл)
Глюкоза 1,000
Пенициллин (105 ME) 0,060
Стрептомицин 0,050
Исходный раствор Б, 10Х ЫаНСОз 2,106
Исходный расгвор В, 10X Пируват натрия 0,36
Исходный раствор Г, 10Х СаС12-2Н20 2,52
Исходный раствор Д, 10 X HEPES перед разведением до 5,957
100 мл довести pH до 7,4
добавлением 2М NaOH
БСА 0,400
Приготовление
Профильтруйте через миллипоровый фильтр (размер пор 0,22 мкм) все
исходные растворы и храните при +4°С в пластиковых пробирках. Растворы А,
Г, Д можно хранить 3 месяца, растворы Б, В - 2 недели.
2. Приготовление 10 мл М16 + БСА или М2+БСА из исходных растворов
Исходный А Б в г д Феноловый Вода БСА pH
раствор красный (Ап alar) (мг)
(мл) (мг) (мл)
М16 1,0 1,0 0,1 0,1 ¦-¦ 0,1 7,8 40 7,6
М2 1,0 0,16 0,1 0,1 0,84 - 7,8 40 7,4
Установите pH. Профильтруйте через миллипоровый фильтр (размер пор 0.22
мкм). Храните удобными аликвотами в пластиковых пробирках при +4 °С. Для
бескальциевых М16 и М2 опустите исходный раствор Г, добавьте 0,1 мл 15
мг/мл NaCI. Приготовьте 6 мг/мл БСА.
4. Если требуются клетки известного возраста, культивируйте
изолированные клетки и ежечасно или каждые полчаса проверяйте их на
предмет делений. Соберите пары клеток, разделившихся в течение выбранного
промежутка времени, и культивируйте, пока они не достигнут нужного
возраста. Если требуются единичные клетки, то образовавшиеся пары
бластомеров разделите еще раз, как было описано.
Как прежде, цитоплазматический мостик служит топографическим маркером
предыдущей борозды дробления.
Стадия 16 клеток - первая стадия, на которой различаются два клеточных
фенотипа (полярные и аполярные) (см. обсуж-
Эксперименты с предпмплантационпыми эмбрионами мыши
45
дение в разд. 4.1). Отбирая потомков единичных бластомерсв 8-клеточной
стадии in vitro, можно разделить эти две субпо-ляции, так как бластомеры
16-клеточной стадии имеют разные размеры: более крупные клетки - полярные
(презумптивные клетки трофэктодермы, ТЭ), а более мелкие - аполярные
Предыдущая << 1 .. 10 11 12 13 14 15 < 16 > 17 18 19 20 21 22 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed