Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
5. Фиксируйте клетки, нанеся пипеткой 70%-ный спирт и высушите на
воздухе.
6. Подсчитайте флуоресцирующие ядра ТЭ и ВКМ, как описано выше.
В литературе имеются данные о возможности дифференциального подсчета
клеток ВКМ и ТЭ в интактной бластоцисте с использованием
полинуклеотидспецифических флуорохромов [35].
3.6.3. Микроденситометрия ядер, окрашенных по фёльгену
О числе клеток можно судить, подсчитывая ядра, окрашенные по Фёльгену.
Содержание ДНК в окрашенных ядрах определяют на интегрирующем
микроденситометре (Vickers М85) путем сравнения с клеточными ядрами
различной плоидиости в высушенных на воздухе препаратах печени мыши [3,
11].
1. Инкубируйте эмбрионы или клеточные агрегаты в течение 15 мин в среде
Хэнкса (Gibco) без Са2+ и Mg2+ при 37 °С, высушите их на воздухе на
чистых предметных стеклах, фиксируйте в смеси этанол : уксусная кислота
(3:1 по объему) в течение 5 мин, а затем в течение 1ч - в смеси этанол :
уксусная кислота: 40%-ный формалин (85:5: : 10 по объему), высушите на
воздухе и храните при -20 °С.
2. Приготовьте основной краситель Шиффа для реакции Фельгена следующим
образом. К 800 мл кипящей биди-
4-171
50
Глава 2
стиллированной воды прибавьте 4,0 г основного фуксина и охлаждайте 30
мин. Внесите 12 г метабисульфита калия, растворенного в 120 мл 1М НС1, и
оставьте раствор на ночь. Обесцветьте раствор перемешиванием с
активированным древесным углем в течение часа, профильтруйте и храните в
темной бутыли при 4°С.
3. Окрасьте препараты реактивом Шиффа. Сначала погрузите в 5М НС1 на 55
мин при 26 °С, затем промойте биди-стиллированной водой в течение 5 мин и
окрасьте свежеприготовленным и профильтрованным реактивом Шиффа 2 ч в
темноте.
4. Промойте трижды по 10 мин в свежеприготовленной сернистой кислоте (т.
е. смеси равных объемов 1%-ного метабисульфита калия и 0,1М НС1).
Промойте водопроводной водой.
5. Проведите обезвоживание в спиртах возрастающей крепости и в ксилоле.
6. Заключите препараты в Depex, храните при 4°С и спустя 2 недели
анализируйте их на интегрирующем микроденситометре (Vickers М85), измеряя
поглощение света с длиной волиы 570 нм. Фиксированные и окрашенные
препараты мышиной печени, анализируемые параллельно во всех
экспериментах, дадут контрольные значения 2С и 4С количеств ДНК.
4. Применение меченых лигандов для изучения организации клеток и
эмбрионов
Для изучения организации, состава и функционирования клеток мышиного
эмбриона на разных стадиях развития применяются многочисленные антитела,
лектины и другие лиганды, меченные флуоресцирующим веществом,
пероксидазой или радиоизотопами (соответствующие обзоры [36-39]).
4.1. Мечение клеток и морфология клеточной поверхности
Лектины и антитела используются для получения количественных сведений о
деталях поверхностной топографии и молекулярной организации эмбриональных
мембран [40], но чаще они выступают в качестве мембранных маркеров,
выявляющих асимметрию в расположении поверхностных микроворсинок на
отдельных бластомерах [12]. У нормально развивающихся эмбрионов эта
поверхностная полярность появляется на 8-клеточной стадии развития. Она
служит свидетельством глубокой реорганизации бластомеров и клеточной
дифференцировки [2].
В зависимости от возраста эмбрионов, времени их диссоциации (до или после
окрашивания) мы можем получить разную
Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши__________51
информацию. Общие поверхностные маркеры (лектины или ан-тимышиные
антитела), применяемые до 8-клеточной стадии, дают гомогенное окрашивание
всех бластомеров до компактп-зации и поляризованное - после компактизации
независимо ог того, были эмбрионы диссоциированы перед окрашиванием или
нет. На 16-клеточной стадии развития компактизация эмбрионов
обусловливает присутствие красителя лишь в наружных клетках, поэтому в
случае окрашивания интактного эмбриона, после его диссоциации можно
идентифицировать меченые (наружные) и немеченые (внутренние) клетки. Если
окрашивание проведено после диссоциации, выявляются два типа клеток -
полярные и неполярные. Если использовать оба подхода и окрасить интактный
эмбрион одним флуорохромом, например изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ),
а затем, после диссоциации, реактивом, связанным с другим флуорохромом,
например изотиоцианатом тетраметилродамина (ТРИТЦ), полярная популяция
(проспективные клетки ТЭ) будет соответствовать наружному положению, а
неполярная популяция (проспективная ВКМ) - внутреннему положению в
интактном эмбрионе [2, 25J.
Соответствующая процедура окрашивания описана ниже, в разд. 4.1.1.
Окрашенные эмбрионы или клетки можно изучать с помощью сканирующей
электронной микроскопии (разд. 4.1.2). При этом получают информацию о
клетках наружного или внутреннего слоев, их фенотипе, количестве. Кроме
того, окрашивание позволяет рассортировать наружные и внутренние клетки
(разд. 3.2, 3.3, 3.4).
4.1.1. Окрашивание эмбрионоа антителами и пектинами
Окрашивание может быть одноступенчатым или "прямым" (с использованием
