Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 24

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 162 >> Следующая

Проблема: яйца или эмбрионы лизируют вскоре после снятия блестящей
оболочки
10. Эмбрионы слишком долго подвергали воздействию растворов, удаляющих
оболочку (особенно кислым раствором Тироде)
11. Растворы токсичны
Ускорьте процедуру. Используйте меиыную партию эмбрионов. Убедитесь в
том, что кислый Тироде применяется при 37 °С. Быстро промойте эмбрионы
М2+БСА и вместо кислого Тироде возьмите проназу (или наоборот)
Проверьте осмоляриость Убедитесь в том, что pH установлена при помощи
Analar-HCl.
Растворы хранились слишком долго. Не замораживайте кислый Тироде.
Выбросьте, и приготовьте новые. Замените запас химикатов
Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши
61
Продолжение табл. 2.6.
Вероятные причины
Способы устранения
Проблема: эмбрионы прекращают развитие на 2-клеточной стадии
12. Использована "блокирующаяся" линия, эмбрионы извлечены нз яйцевода
слишком рано
13. Колебания температуры и (или) pH. Проверьте пп. 5-9
Замените линию мышей. Не извлекайте эмбрионы раньше 32 ч после инъекции
чХГ или позже Проверьте состав и температуру всех сред. Используйте
камеры и нагревательные столики у микроскопов
Проблема: эмбрионы останавливаются в развитии при культивировании на
более поздних стадиях (часто 16-клеточная стадия) после нормального или
замедленного развития (эмбрионы без блестящей оболочки или
диссоциированные клетки особенно чувствительны к токсическим компонентам)
[55]
Проверьте пп. 5-9 и 13
14. Среды токсичны
15. Пластиковые культуральные чашки загрязнены. См. также пп. 6
и 7
16. Неясные помехи по-прежиему остаются
Проверьте БСА. Проанализируйте на. токсичность разные партии сыворотки и
ее источники. Проверьте масло на токсичные примеси:
а) экстрагируйте масло средой в течение ночи при 37 °С в инкубаторе с
С02. Сравните жизнеспособность эмбрионов в среде под. экстрагированным и
неэкстрагиро-ванным маслом;
б) сравните жизнеспособность эмбрионов в каплях объемом 5- 10 и 50 мкл.
Если масло имеет примеси, в маленьких каплях эмбрионы будут
дегенерировать быстрее. Проверьте другие партии масла на 8-клеточных
эмбрионах без оболочки в маленьких каплях среды и купите удачную партию
про запас. Смените реактивы для сред, кислого Тироде и раствора проназы
Проверьте другие упаковки и купите-удачные про запас
Сравните эмбрионы и реактивы с таковыми из другой лаборатории
температуры. Необходимы бинокулярные препаровальные микроскопы (модель М5
Wild Heerbrugg) с увеличениями примерно от Хб до Х50. Их следует держать
в свободном от пыли боксе (Регрех), желательно, чтобы они были снабжены
нагревательными столиками и набором нагревающихся камер до 36±1°С-
62
Глава 2
5.3.3. Инкубаторы
Необходим инкубатор на 37 °С, содержащий 5% С02 в воздухе. Система
контроля концентрации С02 может либо входить в конструкцию инкубатора,
либо придаваться к нему. Если содержание С02 проконтролировать нельзя,
культуральные чашки с эмбрионами помещают в герметически закрытые сосуды,
содержащие 5% С02 в воздухе. Рекомендуется иметь отдельные инкубаторы для
длительного и краткосрочного инкубирования. Последние следует
использовать в тех случаях, когда в ходе эксперимента необходимо часто
анализировать культуры.
5.3.4. Ламинарный бокс
Все среды следует готовить в специальном ламинарном боксе (Slee Model
HLF/H, поставщик: South London Electrical Equipment Ltd.), который не
должен находиться в одном помещении с микроскопами и инкубаторами.
5.3.5. Чашки для манипуляций и культивирования
Для сбора эмбрионов из больших объемов жидкости рекомендуется
пользоваться стеклянными чашками с углублением, Hoslabs. Эмбрионы или
клетки будут скатываться в это углубление.
Для стандартной культуры используются упакованные стерильные пластиковые
чашки Петри (Falcon, Becton Dickinson and Co.) трубки и пипетки. Если
требуется нелипкая поверхность, рекомендуется пользоваться чашками Петри
(поставщик пластиковой посуды: Hawfell).
5.3.6. Стеклянные пипетки
Состав стекла и его толщина, диаметр продажных пастеровских пипеток
настолько варьируют, что неизбежно вызывают затруднения при вытягивании
микропипеток в пламени горелки. По нашему мнению, наиболее подходящими
являются пипетки "Volac" (Fisons Scientific). Ими пользуются для обычного
переноса эмбрионов.
Чтобы изготовить микропипетки для манипуляций с диссоциированными
эмбрионами и единичными клетками, необходимы стеклянные капилляры точного
диаметра (GC 100-15: Clark Electromedical Instruments).
Микропипетки вытягивают и оплавливают в микрокузнице (Microforge de
Fonbrune Establissements Beaudoin). Воспользовавшись пособиями для
изготовления пипеток (AR Honvell, Кат. № 7091 00 и 7091 10), их можно
сделать самим.
Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши___________63
5.3.7. Иглы для вскрытия яйцеводов
Используют металлические иглы 30-го калибра (Holborn Surgical Instruments
Co. Ltd.), у которых скошенные концы
плоско срезаны и отполированы.
5.3.8. Стекла для типирования тканей
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed