Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Поскольку пронуклеусы и ядра яиц и ранних эмбрионов имеют относительно
крупные размеры, введение в яйцо пипетки с диаметром отверстия,
достаточным для захвата такого ядра, обычно необратимо повреждает
мембрану яйца и приводит к лизису. В связи с этим предложен эффективный
метод [1] извлечения ядра в небольшом объеме цитоплазмы. Такие ну-
клеопласты могут быть слиты с другими яйцами или клетками с помощью
вируса Сендай. Указанный метод позволяет получить в ходе одного
четырехчасового эксперимента до 100 энуклеиро-ванных яиц или 40-50
реконструированных яиц.
2. Основная экспериментальная техника
2.1. Культивирование
Яйца культивируют в стандартной среде (М16, [2], гл. 2, разд. 5.2) с 0,4%
БСА (Fraction В, Sigma) в пластиковых чашках Петри (Sterilin) под маслом,
в увлажненной атмосфере
1 S. С, Barton, М. L. Norris, М. А. Н. Surani. AFRC Institute of Animal
Physiology and Genetics Research, Department of Molecular Embryology,
Babra-ham, Cambridge CB2 4AT, UK.
Трансплантация ядер в яйца
301
с 5% С02 при 37,5-38,5°С (см. гл. 2, разд. 1). Манипуляции проводят в
забуференной фосфатом среде с 0,4% БСА (РВ1, [3], гл. 13, разд. 3.1.1), к
которой в большинстве случаев добавляют 1 мкг/мл цитохалазина D (ЦХД)
(Sigma) и 0,1 мкг/мл нокодазола (Sigma), растворенных в
диметилсульфоксиде (ДМСО). Разрушение микрофиламентов (воздействием ЦХД)
и микротрубочек (нокодазолом) делает яйца более пластичными и устойчивыми
к повреждению при манипуляциях. Исходные растворы ЦХД в концентрации 2
мг/мл ДМСО и нокодазола при 0,2 мг/мл ДМСО хранят в виде небольших
аликвот при -20 °С до 6 мес. Непосредственно перед употреблением по 1 мкл
каждого из этих реагентов добавляют к 2 мл РВ1 (PNC). Яйца небольшими
группами переносят для манипуляций в PNC и затем быстро отмывают, так как
воздействие нокодазолом свыше 4 ч может оказаться повреждающим.
Для культивирования следует использовать легкое жидкое парафиновое масло
(масса 1 мл при 20°С ~0,846 г), а для
манипуляционных камер и инструментов - тяжелое (масса на мл при 20°С
~0,875 г). И то и другое поставляется фирмой BDH. Перед употреблением
каждую партию масла необходимо проверять на токсичность. Стерилизовать
масло мы не считаем обязательным. Достаточно его профильтровать через
ватманов-скую бумагу № 1, разлить в чистые стерильные пузырьки и хранить
закрытым.
2.2. Приготовление препарата вируса Сендай
Вирус Сендай, или гемагглютинирующий вирус (японский штамм), используется
в качестве фузогена (фактора, вызывающего слияние клеток). Процедура
выращивания вируса в развивающихся куриных яйцах подробно изложена в
работах [4,
5], мы приводим ее краткое описание.
1. Проинкубируйте свободные от вируса оплодотворенные куриные яйца на
боку при 30 °С в течение 11 дней.
2. Поместите яйца в просвечивающее устройство для обнаружения эмбриона,
который выявляется в виде темной тени в центре яйца, и на каждом яйце
отметьте место инъекции - между двумя основными венами вблизи воздушной
камеры.
3. Слегка протрите яйца 70%-ным спиртом и подпилите скорлупу в месте
инъекции.
4. Стерильным шприцем с инъекционной иглой 25-го калибра введите 0,1 мл
вируса, разведенного солевым раствором Хенкса без глюкозы до концентрации
0,1 гемагглю-тинирующих единиц (ГАЕ) на яйцо. Для этого погрузите иглу на
глубину примерно 1 см, направив ее к заост-
302
Глава 12
ренному концу яйца, и медленно инъецируйте суспензию вируса в яйцо.
5. Заклейте отверстие в скорлупе расплавленным парафином и инкубируйте
яйца в течение 3 дней, установив их на заостренных концах, при 30 °С.
6. После этого инкубируйте их в течение ночи при 4°С, чтобы убить
эмбрионы и предотвратить кровотечение при сборе жидкости из аллантоиса.
7. Быстро соберите вирус при 4°С, чтобы получить высокий титр. В
стерильных условиях срежьте верхушку скорлупы яйца. Разрежьте оболочку
аллантоиса и извлеките пипеткой его жидкость. Жидкость должна быть мутной
и бледно-желтого цвета; образцы, загрязненные желтком и кровью,
отбросьте.
8. Соедините жидкость, собранную из всех яиц, и поместите на лед.
9. Центрифугируйте при 3000 об/мин в течение 10 мин.
10. Удалите супернатант и центрифугируйте снова при 15000 об/мин в
течение 1 ч при 4°С. Диспергируйте образовавшийся белый сгусток в 1 мл
холодного раствора Хенкса без глюкозы.
11. Возьмите небольшую пробу и определите число гемаг-глютинирующих
единиц [4]. Разведите препарат раствором Хенкса без глюкозы до 20 000
ГАЕ/мл.
12. Заморозьте аликвоты по 1 мл на сухом льду и храните при -70 °С.
Препаратом вируса Сендай можно пользоваться для слияния клеток в течение
нескольких лет.
Прежде чем использовать вирус Сендай в экспериментах по слиянию клеток,
его нужно инактивировать. Это можно сделать двумя способами. При
инактивации ультрафиолетом у некоторых вирусных частиц иногда сохраняется
инфекционность, что в высшей степени нежелательно. Гораздо эффективнее
химический метод инактивации с помощью бета-проприолактона (БПЛ) [6].
