Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
Трансплантация ядер в яйца
305
Чтобы получить тонко оттянутые микропипетки, нужен простой электродный
прибор для оттягивания пипеток. Приборы различных конструкций можно
приобрести или усовершенствовать в лабораторной мастерской. Для
разламывания, изгибания и полировки кончиков микропипеток требуется
микрокузница де Фонбрюна (Beaudouin, Paris), которая дает увеличение
примерно в 100 раз и высокую точность. Микроскоп кузницы должен быть
снабжен окуляр-микрометром. В качестве нагревательной нити используется
платиновая или платино-иридиевая проволока длиной 2,5 см (диаметр 0,25-
0,3 мм), изогнутая V-образна и горизонтально расположенная. Для придания
заостренной конической формы иглам, с помощью которых переносятся ядра,,
к нагревательной нити припаяны два стеклянных шарика-- один на ее
вершине, а другой на верхней поверхности вблизи вершины (см. также гл. 3,
разд. 9.2).
Кроме того, требуются некоторые приспособления для заострения кончиков
игл для переноса ядер. Их можно приобрести или сделать в мастерской. В
нашей лаборатории используется шлифовальная поверхность, представляющая
собой стеклянную-пластинку, покрытую очень тонким алмазным диском,
вращающимся со скоростью 200 об/мин (рис. 12.1).
2.4. Изготовление микроинструментов
Мы описываем ориентацию инструментов на микрокузнице такой, как она есть
в действительности, а не такой, какой мы ее видим в микроскопе кузницы,
так как инверсии в микроскопах разных марок варьируют. Для приготовления
стеклянных микроинструментов используют стандартные капиллярные трубки из
боросиликонового стекла, их наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр
0,58 мм, длина 15 см; поставщики: Leitz,. Clark Electromedical
Instruments; Drummond Scientific Co. Другие типы стекла, например Ругех,
при вытягивании и заострении проявляют иные свойства.
2.4.1. Удерживающие пипетки
1. Вытягивайте капиллярную трубку вручную над маленькой бунзеновской
горелкой, пока наружный диаметр не уменьшится до 80-100 мкм, затем
сломайте ее на расстоянии 1,5-2 см от места сужения трубки. Оставьте
основной стержень длиной около 4 см.
2. Укрепите пипетку на микрокузнице в горизонтальном положении и
определите размер и характер разлома.
3. Если кончик абсолютно прямой, раскалите нить докрасна и приблизьте к
кончику, чтобы его оплавить и сократить отверстие до 20 мкм в диаметре
(рис. 12.2, Л).
306 Глава 12
Рис. 12.1. Шлифовальное устройство, изготовленное в лабораторной
мастерской. Пипетка зажимается клеммой, прикрепленной к видоизмененному
штативу микроскопа. Для освещения используется осветитель. Пипетка
устанавливается над шлифовальной поверхностью с помощью ручной лупы.
Шлифовальная поверхность поддерживается влажной с помощью марлевого
тампона, смачиваемого дистиллированной водой.
4. На удерживающей пипетке должен быть небольшой изгиб в месте ее
сужения для того, чтобы при горизонтальном положении пипетки ее кончик
находился выше плеча.
Для этого поверните пипетку основанием вверх, нагрейте нить и приблизьте
ее к месту сужения пипетки; и без соприкосновения с нитью пипетка будет
медленно изгибаться (рис. 12.2,5).
2.4.2. Иглы для переноса ядер
1. Силиконируйте стеклянную капиллярную трубку изнутри и снаружи,
погрузив ее в силиконовый раствор н высушив в горячей печи.
2. Отрегулируйте оттягиватель игл таким образом, чтобы вытянуть иглу, у
которой вершина сужения расположена на расстоянии 8--9 мм от первого
расширения трубки. Оставьте толстый стержень иглы длиной около 4,5 см.
3. Укрепив иглу горизонтально на микрокузнице, очень
Трансплантация ядер в яйца
307
=^>
Рис. 12.2. А. Удерживающая пипетка: схема готового конца пипетки. Б.
Придание изгиба плечу пипетки.
внимательно осмотрите ее конец, чтобы убедиться в постепенности
конического сужения.
4. Сделайте прямой разлом в том месте, где наружный диаметр равен 20-30
мк. Чтобы скол получился правильным, следует поступить так. Нагревайте
нить накаливания, пока она не начнет менять цвет, и осторожно сплавьте
маленький стеклянный шарик на наружной поверхности вершины нити с тонким
стержнем изготавливаемой иглы в нужной точке. Когда стекло плотно
прикрепится, но не изогнется и не сузится в месте прикрепления, выключите
нагревание; внезапное сокращение охладившейся нити накаливания чисто
расколет стекло (рис. 12.3, Л).
5. Заостряйте пипетку в течение 30-60 сек на шлифовальном устройстве,
сделав на ее конце скос под углом 35°.
6. Тщательно промойте в серной кислоте, сполосните дистиллированной водой
(ДВ), обработайте детергентом NP-40 (он повышает неадгезивность
силиконированной поверхности) и, наконец, промойте дистиллированной
водой. Чтобы осуществить эти процедуры, пипетку с помощью короткого
пластикового шланга необходимо присоединить к игле маленького шприца и
прогнать жидкости через кончик пипетки вперед и назад. В нашей
лаборатории используется такой режим отмывки:
1. ДВ трижды 5. ДВ трижды
2. H2S04 трижды 6. NP-40 трижды
